大慶自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及耐酸菌株初步篩選

李 欣，武俊瑞，田 甜，岳喜慶*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

大慶自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及耐酸菌株初步篩選

李 欣，武俊瑞，田 甜，岳喜慶*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

從黑龍江大慶地區(qū)采集7份采用傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵酸菜發(fā)酵液，從中分離和篩選出14株乳酸菌疑似菌株，提取其16S rDNA，并經(jīng)測序、同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等方法，對其屬種進行鑒定。初步篩選出在pH值為2.5、3.0和3.5的酸性條件下均能夠生長的耐酸菌株6株，并進一步利用活菌計數(shù)法得出菌株在pH3.0條件下的存活率。結(jié)果表明：14株菌株均為乳酸菌，其中4株為彎曲乳桿菌（HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1），1株為短乳桿菌（HD18-2），3株為清酒乳桿菌（HD12-2、HD13-1和HD16-5），1株為腸膜明串珠菌（HD18-3），5株為植物乳桿菌（HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4），且篩選出pH 3.0條件下存活率在2%以上的6株菌株，分別為HD12-1、HD13-1、HD14-1、HD15-1、HD16-2和HD16-5。

酸菜發(fā)酵液；乳酸菌；耐酸；鑒定

酸菜是我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，多年來深受百姓的歡迎，同時酸菜也是優(yōu)良乳酸菌的豐富資源庫。自然發(fā)酵的酸菜口味純正，但制作工序繁瑣，如何使工業(yè)生產(chǎn)的酸菜擁有自然發(fā)酵酸菜的口味一直是人們研究的課題[1]。乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳制品必不可少的微生物菌種，它不僅可以改善食品風(fēng)味，提高乳制品的營養(yǎng)價值、保藏性和附加值，而且乳酸菌的益生作用是十分突出的，乳酸菌對于腸道中的有益菌群具有多種保健功能[2]。目前普遍使用的乳酸菌鑒定方法有傳統(tǒng)的生理生化方法和分子鑒定。但是傳統(tǒng)的鑒定方法耗時費力，操作中不穩(wěn)定性因素多，很容易造成鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，近年來分子鑒定的手段被越來越多的采用[3]。16S rDNA序列同源性分析就是一種分子水平上鑒定乳酸菌菌種的手段，這種鑒定方法使我們能夠從分子和基因水平上認識乳酸菌的多樣性[4-7]。

本研究擬利用選擇性培養(yǎng)，從7份采自黑龍江大慶地區(qū)農(nóng)戶采用傳統(tǒng)方法制作的酸菜汁中分離出乳酸菌菌株14株，對其進行16S rDNA序列同源性分析，并進行耐酸菌株的初步篩選，為進一步進行深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自黑龍江省大慶地區(qū)農(nóng)戶采用傳統(tǒng)方法制作的7份自然發(fā)酵酸菜汁樣品。

MRS培養(yǎng)基參照文獻[8-9]；細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、DNA Marker 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XS-212型生物顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25型pH計 上海雷磁儀器廠；Coolsafer55-4型冷凍干燥機 美國基因有限公司；DYY-8C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 普陽科學(xué)儀器研究所；DNA擴增儀 美國Bio-Rad公司；CR-21G冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從黑龍江省大慶地區(qū)采集7份農(nóng)戶采用傳統(tǒng)方法腌制的酸菜發(fā)酵液，測定樣品pH值和溫度，并記錄腌制時間，并將樣品分裝于滅菌的離心管中，采用冰盒保藏，運回實驗室中于－80℃冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

取酸菜發(fā)酵液樣品過濾除雜后，吸取1 mL采用傾注培養(yǎng)法接種于含有體積分數(shù)2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，于30℃厭氧培養(yǎng)36～48 h后，挑取有溶鈣圈的單個菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24～36 h，劃線分離2～3次，取白色或乳白色單個菌落觀察其菌落特征和菌體特征，并作記錄，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的單個菌落[10-13]，分別進行4℃斜面短期保藏[14]和冷凍干燥長期保藏[10-13]。

1.4 16S rDNA序列分析

1.4.1 菌株DNA的提取

將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h后，4 000 r/min離心10 min收集菌種，并用滅菌生理鹽水洗滌，傳代培養(yǎng)2～3次后，利用天根細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取菌體DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4.2 16S rDNA基因序列PCR擴增

PCR擴增采用細菌通用引物。正向引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物為1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴增體系總體積50.0 μL，包括1.0 μL基因組DNA，5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+），1.0 μL Taq聚合酶（5 U/μL），1.0 μL dNTP（10 mmol/L），1.5 μL正向27F引物，1.5 μL反向1492R引物，39.0 μL ddH2O。采用超純無菌水替代基因組DNA作為PCR陰性對照。

PCR擴增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，72℃終延伸7 min，共進行45個循環(huán)[15-17]。

PCR擴增產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往北京擎科新業(yè)生物公司進行序列測定。

1.4.3 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

登陸NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）網(wǎng)站，進行同源性分析，并采用MEGA 5.0軟件將測得序列與GenBank中的模式菌株16S rDNA序列進行分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得目的菌的分類地位或它的系統(tǒng)發(fā)育地位[18-20]。

1.5 耐酸菌株的初步篩選

將分離鑒定得到的14株菌株分別接種于pH值為2.5、3.0和3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況，能生長的菌株作為可能具有潛在耐酸特性的菌株。選取在pH值為2.5、3.0和3.5條件下均能生長的菌株，制備純凈的菌懸液，并將菌懸液以2%的接種量接種到pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 h，分別取0 h和2 h的菌液傾注平板進行活菌計數(shù)，并計算存活率，以此判斷菌株在pH 3.0條件下的耐酸能力[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集情況

從大慶所采集7份樣品的pH值、溫度、腌制時間等情況如表1所示。所采集7份樣品的pH值在3.8～6.2，溫度在3.4～20.0℃，腌制時間在55～80 d。發(fā)酵液均偏酸性，溫度和腌制時間存在差異。

表1 樣品采集Table 1 Pick juices from different fermentation conditions

2.2 菌落及菌體特征

2.2.1 菌落特征

從7份樣品中分離得到14株直徑在1.0～2.0 mm、乳白色圓形菌落的乳酸菌疑似菌株，對其編號，觀察并記錄各株菌菌落特征，如表2所示，部分菌株菌落形態(tài)如圖1所示。由表2可知，從7份樣品中選取14個疑似乳酸菌菌落，其菌落直徑均在1.1～2.0 mm，且均為邊緣規(guī)則、乳白色的圓形菌落。其中，HD12-1、HD12-2、HD13-1、HD13-5這4個菌落表面較濕潤，其余菌落表面均濕潤；HD12-1、HD12-2、HD13-5、HD14-1、HD14-3、HD18-3這6個菌落表面不光滑，其余菌落表面均光滑。

表2 供試菌株菌落特征Table 2 Colony characteristics of 14 suspected strains

圖1 部分菌株菌落照片F(xiàn)ig.1 Colonies of five of the suspected strains

2.2.2 菌體特征

表3 供試菌株菌體特征Table 3 Bacterial characteristics of 14 suspected strains

分別對上述14株菌進行革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗，并于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察革蘭氏染色結(jié)果、菌體形態(tài)及特征，如表3所示，部分供試菌株革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示。14株菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的單一菌株，其中HD18-2為極短桿菌，HD18-3為球菌，其他菌株均為短桿菌，且菌體的排列方式有鏈狀和單個排列。

圖2 部分菌株革蘭氏染色照片F(xiàn)ig.2 Observation of Gram-stained strains

2.3 16S rDNA序列同源性分析

2.3.1 菌株基因組DNA提取

圖3 DNA檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of genomic DNA samples isolated from 14 suspected strains

采用試劑盒提取菌株基因組DNA，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測電泳圖有且只有一個條帶，則可進行16S rDNA基因序列PCR擴增，如圖3所示，各菌株DNA提取產(chǎn)物條帶單一，可以滿足PCR擴增的要求。

2.3.2 16S rDNA基因序列PCR擴增

將各菌株基因組DNA進行16S rDNA基因序列PCR擴增，同時進行PCR陰性對照實驗，擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。PCR陰性對照無條帶，各菌株P(guān)CR產(chǎn)物條帶單一，在1 500 bp處有特異性條帶，滿足測序的要求。

圖4 PCR產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR products

2.4 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

2.4.1 16S rDNA同源性對比

利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST），將所測定的14株菌株的16S rDNA序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA/ rRNA序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，結(jié)果如表4所示。

表4 16S rDNA同源性序列對比結(jié)果Table 4 Alignment of homologous 16S rDNA sequences among 14 suspected strains ains

將14株菌的16S rDNA序列與GenBank中的已知序列進行對比可知，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌與彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）同源性最高；菌株HD18-2與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）同源性最高；菌株HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌與清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）同源性最高；菌株HD18-3與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）同源性最高；菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4等5株菌與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，且14株菌株的同源性均可達到99%以上。

2.4.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree for 14 lactic acid bacteria (LAB) and other related bacteria based on their 16S rDNA sequences

將測定菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌與彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）系統(tǒng)位置最為接近，HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌與清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）系統(tǒng)位置最為接近，菌株HD18-2與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）系統(tǒng)位置最為接近，菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3和HD17-4等5株菌與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）系統(tǒng)位置最為接近。根據(jù)16S rDNA同源性對比結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HD12-1、HD13-5、HD14-1和HD15-1等4株菌鑒定為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus），HD12-2、HD13-1和HD16-5等3株菌株鑒定為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），菌株HD18-2鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株HD14-3、HD15-2、HD16-2、HD17-3 和HD17-4等5株菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

近年來，對于乳酸菌的研究越來越受到關(guān)注，研究的技術(shù)方法也日趨成熟。張楊[11]、陳曉平[1]、張魯冀[22]等從自然發(fā)酵酸菜汁中分離鑒定出干酪乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、植物乳桿菌、米酒乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和腸膜明串珠菌。其中，陳曉平等[1]從自然發(fā)酵酸菜汁中分離出3株高產(chǎn)酸菌株分別為腸膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳酸桿菌。烏日娜[15]、艾日登才次克[18]等將酸馬奶等內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離得到的乳酸菌菌株進行分子生物學(xué)鑒定。

2.5 耐酸菌株初步篩選

將14株乳酸菌菌株分別接種于pH值為2.5、3.0和3.5的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察生長情況，初步判定其是否具有耐酸特性，如表5所示。注：－.不生長；+.生長情況一般；++.生長情況良好。

表5 菌株在不同pH值條件下的生長情況Table 5 Growth of 14 LAB strains at pH 2.5, 3.0 and 3.5

選取在pH值分別為2.5、3.0和3.5條件下均能生長的菌株HD12-1、HD13-1、HD14-1、HD15-1、HD16-2、HD16-5進行pH 3.0條件下存活率實驗，如表6所示。

表6 菌株在pH3.0條件下存活率Table 6 Survival rates of six selected strains at pH 3.0

由表6可知，菌株在pH 3.0條件下培養(yǎng)2 h后，菌落數(shù)均有所下降。存活率最高的乳酸菌菌株為HD16-2，達到10.73%，存活率最低的菌株為HD14-1，2.45%。6株乳酸菌菌株的存活率均在2%以上，可以作為具有潛在益生特性的耐酸乳酸菌菌株。

3 結(jié) 論

本實驗從7份采自黑龍江大慶地區(qū)的傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵液中提取出14株菌株，對其進行16S rDNA序列同源性分析，并進行了耐酸特性的篩選。結(jié)果表明，14株菌株中包括4株彎曲乳桿菌、1株短乳桿菌、3株清酒乳桿菌、1株腸膜明串珠菌和5株植物乳桿菌，其中6株菌株在pH3.0條件下生存能力較強。本實驗篩選出的乳酸菌菌株來源于傳統(tǒng)的自然發(fā)酵制品，且經(jīng)過篩選均為具有潛在益生特性的菌株，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 陳曉平, 劉華英, 魏小川, 等. 自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(2): 91-94.

[2] NORAPHST H, SUBAIDAH B, SAOWAKON W, et al. Isolation and screening of lactic acid bacteria from Thai traditional fermented fish (Plasom) and production of Plasom from selected strains[J]. Food Control, 2011(22): 401-407.

[3] 龐會利, 談重芳, 蔡義民, 等. 乳酸菌分類鑒定方法的研究進展[J].中國釀造, 2009(6): 1-5.

[4] FAYE T, TAMBURELLO A, BEGARUD G E, et al. Survival of lactic acid bacteria from fermented milks in an in vitro digestion model exploiting sequential incubation in human gastric and duodenum juice[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95(2): 558-567.

[5] 王曦, 許曉燕, 余夢瑤, 等.乳酸菌的保健功能及其作用機制研究進展[J]. 中國乳品工業(yè), 2010, 38(9): 38-41.

[6] SEBASTIAN P, HERR P, FISCHER U, et al. Molecular identification of lactic acid bacteria occurring in must and wine[J]. South African Journal for Enology and Viticulture, 2011, 32(2): 300-309.

[7] 劉海燕, 蘇秀俠, 陳群. 乳酸菌基因組學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2009, 36(11): 60-62.

[8] 凌代文, 東秀珠. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999.

[9] 王友湘, 陳慶森, 閻亞麗. 用于乳酸菌分離鑒定的幾種培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 374-378.

[10] YU J, WANG W H, MRNGHE B L, et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with traditional fermented dairy products in Mongolia[J]. Journal of Dairy Science, 2011, 94(7): 3229-3241.

[11] 張楊, 孟祥晨. 自然發(fā)酵酸菜中乳桿菌的分離鑒定與多態(tài)性分析[J].中國乳品工業(yè), 2009, 37(2): 19-22.

[12] 朱小紅, 楊振泉, 顧瑞霞, 等. 新疆傳統(tǒng)乳制品中優(yōu)良乳酸菌的篩選及多菌株發(fā)酵劑的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(12): 30-34.

[13] LIU Wenjun, BAO Qiuhua, JIN Rimutu, et al. Isolation and identification of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE analysis[J]. Microbiological Research, 2012(167): 110-115.

[14] MUYANJA C M B K, NARBHUS J A, TREIMO J, et al. Isolation, characterisation and identification of lactic acid bacteria from bushera: a Ugandan traditional fermented beverage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80: 201-210.

[15] 烏日娜, 張和平, 孟和畢力格. 酸馬奶中乳桿菌Lb.casei Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚類分析[J]. 中國乳品工業(yè), 2005, 3(6): 4-9.

[16] 姚文, 朱偉云, 韓正康. 應(yīng)用變性梯度凝膠電泳和16S rDNA序列分析對山羊瘤胃細菌多樣性的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(9): 1374-1378.

[17] 熱娜·米吉提, 古麗斯瑪依·艾拜都拉, 蘇豫梅, 等. 新疆飼料乳酸菌的多樣性與系統(tǒng)進化分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(6): 3253-3257.

[18] 艾日登才次克, 于潔, 杜曉華, 等. 16S rDNA-RFLP法快速鑒定蒙古國傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2009, 11(2): 63-68.

[19] 應(yīng)燕玲, 許先國, 朱發(fā)明, 等. 16S rDNA快速鑒定的測序方法的建立血液制品中污染細菌[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2009, 29(10): 880-883.

[20] XIE Jianping, JIANG Hongchen, LIU Xinxing, et al. 16S rDNA based microbial diversity analysis of eleven acid mine drainages obtained from three Chinese copper mines[J]. Journal of Central South University of Technology, 2011, 18: 1930-1939.

[21] 石月峰. 對新疆少數(shù)民族自制酸奶樣品進行乳酸菌的分離、篩選及中試實驗研究[D]. 烏魯木齊: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[22] 張魯冀, 孟祥晨. 自然發(fā)酵東北酸菜中乳桿菌的分離與鑒定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(11): 125-131.

Isolation, Identification and Preliminary Screening of Acid-Tolerant Lactic Acid Bacteria from Naturally Fermented Pickle Juices from Daqing

LI Xin, WU Jun-rui, TIAN Tian, YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Fourteen strains of suspected lactic acid bacteria were isolated from 7 naturally fermented pickle juices gathered from Daqing, Heilongjiang Province. 16S rDNA was extracted from each of these bacterial strains using a bacterial genomic DNA extraction kit. The species were identified by DNA sequencing, homology analysis and phylogenetic tree. The results indicated that the all 14 strains belonged to lactic acid bacteria, including 4 strains of Lactobacillus curvatus (HD12-1, HD13-5, HD14-1 and HD15-1), 1 strain of Lactobacillus brevis (HD18-2), 3 strains of Lactobacillus sakei (HD12-2, HD13-1 and HD16-5), 1 strain of Leuconostoc mesenteroides (HD18-3), and 5 strains of Lactobacillus plantarum (HD14-3, HD15-2, HD16-2, HD17-3 and HD17-4). Among these strains, 6 strains, including HD12-1, HD13-1, HD14-1, HD15-1, HD16-2 and HD16-5, were able to grow at pH 2.5, 3.0 or 3.5, with a survival rate above 2% at pH 3.0.

pickle juice; lactic acid bacteria; acid tolerance; identification

TS201.3

A

1002-6630(2014)01-0150-05

10.7506/spkx1002-6630-201401029

2012-12-29

國家“863”計劃項目（2011AA100902）；國家自然科學(xué)基金項目（31000805）；遼寧省教育廳科學(xué)研究項目（L2012249）

李欣（1987—），女，碩士研究生，研究方向為動物性食品加工。E-mail：xiaomaxiaozhu@163.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail：yxqsyau@126.com