絞股藍愈傷組織增殖及芽分化研究

蔡正旺 劉靜

摘要：以絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）莖段為外植體，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑，篩選誘導(dǎo)愈傷組織增殖、芽分化以及生根的最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明，絞股藍最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+ 2，4-D 2.O m～L+ NAA 0.01 mg/L，愈傷組織體積增加2.7倍;最適芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，平均生芽數(shù)為5.7;最適生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L NAA，生根率為91%。

關(guān)鍵詞：絞股藍（Cyno.stemma pentaphyllum）;愈傷組織;增殖;分化

中圖分類號：Q942.6

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0158-03

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8 114.2020.08.036

絞股藍（Gvno.stemma pentaphyllum）別稱葉膽、七葉參、五葉參、小苦藥等，為多年生宿根植物，隸屬于葫蘆目（ Cucurbitales）葫蘆科（Gucurbitceae）絞股藍屬（Cynostemma），廣泛分布于亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)[1]。絞股藍具有較高的食用價值和藥用價值，其莖葉中含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素類、有機酸、無機酸、多種皂苷以及多種微量元素等成分[2，3]。目前，人們普遍采用種子繁殖、分株繁殖、扦插繁殖等方法擴大資源，但這些方法各有不同的缺點，對絞股藍進行快速繁殖研究很有必要。研究表明，絞股藍具有降血脂、降低血糖、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、保護肝臟增強、機體免疫功能等效果[4-6]。劉世彪等[7]和劉曉燕[8]對絞股藍進行了快速繁殖研究。

本研究采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了絞股藍組培快繁體系，對擴大種植、加速絞股藍的開發(fā)利用、解決絞股藍資源匱乏等具有現(xiàn)實意義。通過不同配比植物生長調(diào)節(jié)劑篩選出誘導(dǎo)愈傷組織增殖、芽分化及生根的最適培養(yǎng)基，可以縮短絞股藍育種時間，起到快速繁殖作用，短期內(nèi)得到品質(zhì)優(yōu)良的絞股藍種苗，可為大規(guī)模種植絞股藍提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

絞股藍原材料取自陜西省平利縣，取其幼嫩莖段。

1.2方法

1.2.1 絞股藍愈傷組織的誘導(dǎo)取長3-5 cm絞股藍幼嫩莖段，流水沖洗3-4 h，然后在無菌條件下用75%乙醇溶液消毒30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡7-10 min，最后用無菌水清洗3-5次，在超凈工作臺上將滅菌后的莖段切成0.5-1.0 cm，接人培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

以絞股藍莖段為外植體，培養(yǎng)基采用MS+6-BA l.0 mg/ L+NAA 0.02 mg/L，誘導(dǎo)愈傷組織，每瓶接種3-4個外植體。接種后置于溫度為（25+2）℃、弱光培養(yǎng)30d。培養(yǎng)基以8 g/L的瓊脂固化，添加3%的蔗糖，pH調(diào)節(jié)至5.8。

1.2.2絞股藍愈傷組織的增殖將愈傷組織接種于含有不同濃度配比植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA、KT、2，4-D）的增殖培養(yǎng)基中（表1），培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)時間30 d。

1.2.3絞股藍愈傷組織的芽分化將絞股藍愈傷組織接種在不同培養(yǎng)基上，每個處理接種10瓶，每瓶3-4個外植體，比較不同濃度6-BA、NAA組合（表2）對愈傷組織芽分化的影響。培養(yǎng)條件同上，30 d后統(tǒng)計平均分化芽數(shù)，觀察芽的長勢。平均分化芽數(shù)=誘導(dǎo)的不定芽總數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)。

1.2.4絞股藍生根壯苗愈傷組織誘導(dǎo)出芽后，待芽長至3-5 cm時，挑選生長狀況一致的苗，接種在不同處理生根培養(yǎng)基中（表3），每個處理接種10瓶，每瓶3-4個外植體，培養(yǎng)條件同上。接種30 d時統(tǒng)計生根率、根的長勢。生根率=生根的芽數(shù)/接種的總芽數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度配比植物生長調(diào)節(jié)劑對絞股藍愈傷組織增殖的影響

觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織多為淡綠色、淡黃色，質(zhì)地較為致密（圖la），部分愈傷組織體積增長不明顯，不定芽生長較為旺盛（圖lb）。結(jié)果（表4）表明，不同濃度配比的6-BA、NAA、2，4-D、KT對絞股藍愈傷組織的增殖有較大的影響。細胞分裂素含量高的培養(yǎng)基，愈傷組織體積增長明顯，細胞分裂素含量低的培養(yǎng)基，如處理3與處理4，愈傷組織幾乎沒有增殖，NAA濃度為0.01-0.05 mg/L時，愈傷組織增殖明顯;6-BA、2，4-D、KT濃度為2 mg/L時，愈傷組織增殖明顯。在8種培養(yǎng)基中，處理7愈傷組織增殖倍數(shù)最大，愈傷組織淡黃色或白色，質(zhì)地致密，生長旺盛，平均體積增長倍數(shù)為2.7。

2.2不同濃度配比植物生長調(diào)節(jié)劑對絞股藍愈傷組織芽分化的影響

將增殖的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中，部分愈傷組織分化的芽數(shù)較多，翠綠，有個別分化芽生長旺盛（圖2a）。部分愈傷組織只長出0.5-1.0 cm長較細的根，無不定芽長出（圖2b）。結(jié)果（表5）表明，不同濃度配比的6-BA、NAA對絞股藍愈傷組織的芽分化有較大的影響。6-BA濃度為2.0 mg/L時，平均生芽數(shù)較高;6-BA濃度為3.0 mg/L時，平均生芽數(shù)較低;6-BA濃度為1.0 mg/L時無不定芽長出，僅長出大量0.5-1.0 cm長的根。處理2培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L平均分化芽數(shù)最多。

2.3不同濃度配比植物生長調(diào)節(jié)劑對絞股藍生根的影響

將絞股藍愈傷組織根分化良好的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，17 d后開始生根，30d后部分根較粗且長，生有較多根毛（圖3a），有的根細而長（圖3b），也有幼苗沒有生根。結(jié)果（表6）表明，MS、1/2 MS和1/4 MS基本培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)不定芽生根，但生根率和根的長勢有差異，其中MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/LNAA誘導(dǎo)的根長勢旺盛，苗長勢良好，生根率達到9l%。

3小結(jié)與討論

絞股藍愈傷組織增殖最適培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L。2，4-D對絞股藍愈傷組織增殖的作用較好，能形成質(zhì)地較為致密的愈傷組織。6-BA和KT對絞股藍愈傷組織的增殖都有積極作用。絞股藍愈傷組織芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。劉世彪等[7]研究表明莖尖愈傷組織叢生芽分化最適培養(yǎng)基為MS+BA l.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，武蕓等[9]研究認為愈傷組織芽分化的適宜培養(yǎng)基MS+BA l.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L。絞股藍幼苗生根最適培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加較低濃度的NAA，生長素濃度過高不利于根的生長。武蕓等[9]的研究發(fā)現(xiàn)恩五葉蜜甜味絞股藍生根的最適培養(yǎng)基是1/2 MS+NAA l.0mg/L+PPP3330.2 mg/L。劉世彪等[10]研究認為廣西絞股藍最適的生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L。

參考文獻：

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[8]劉曉燕絞股藍的莖段培養(yǎng)及試管繁殖[J].耕作與栽培，2000（1）：46-47.

[9]武蕓，鄭小江，武玉蓮，等.恩五葉蜜甜味絞股藍快繁體系的建立優(yōu)化[J]湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（1）：27-30

[10]劉世彪，李馨蕓，龍華，等.廣西絞股藍的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].氨基酸和生物資源，2012，34（1）：29-32

基金項目：安康學(xué)院高層次人才啟動項目（AYQDZR2叭212）

作者簡介：蔡正旺（1977-），男，陜西安康人，講師，碩士，主要從事生物資源及植物科學(xué)等有關(guān)的教學(xué)及科研T作，（電話）13772223205（電子信箱）707083838@qq.com。