彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤C-MYC、BCL2基因異常的臨床病理分析

何銀珠，陳寶珍，王曉江，師 怡，陳芳芳，陳燕坪

(1.福建省腫瘤醫(yī)院,福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院分子病理室，福建 福州 350104；2.福建省腫瘤醫(yī)院,福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，福建 福州 350104)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL，diffuse large b-cell lymphoma)是非霍奇金淋巴瘤(NHL,non-Hodgkin lymphoma)最常見(jiàn)的類(lèi)型之一，占所有淋巴瘤的30%～40%，在我國(guó)的發(fā)病率高達(dá)50%，其侵襲性高、預(yù)后差、不同遺傳和分子特征影響DLBCL臨床預(yù)后和治療反應(yīng)[1]。2016年的WHO淋巴腫瘤分類(lèi)中將伴有C-MYC和BCL2或(和)bcl6重排的高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤定義為雙重打擊淋巴瘤(DHL,double-hit lymphoma)或三重打擊淋巴瘤(THL, Triple-hit lymphoma)作為一個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)。此外，C-MYC和BCL2蛋白高表達(dá)的雙表達(dá)淋巴瘤(DEL, double-expression lymphoma)[2],C-MYC和BCL2基因的拷貝數(shù)變化(CNA，copy number aberration)也可以作為DLBCL的重要預(yù)后指標(biāo)[3]。本研究分析了42例DLBCL患者中C-MYC、BCL2基因表達(dá)與臨床病理資料關(guān)系，為指導(dǎo)治療和評(píng)估預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2015年10月～2019年1月福建省腫瘤醫(yī)院病理科確診的、有研究?jī)r(jià)值的DLBCL患者42例，所有的病例均符合2008版WHO造血和淋巴組織腫瘤分類(lèi)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有完整的病理資料。本研究工作經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

1.2采用羅氏Benchmark XT Ventanna全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置：染色程序，進(jìn)行C-MYC、BCL2自動(dòng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)。C-MYC、BCL2 為 Dako公司產(chǎn)品，染色按照要求在每張組織芯片中設(shè)陽(yáng)性對(duì)照片。陽(yáng)性率以陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比表示，C-MYC蛋白陽(yáng)性率≥40%為高表達(dá)，BCL2陽(yáng)性率≥70%為高表達(dá)[4]，所有評(píng)判均由2名高年資病理醫(yī)師完成。

圖1 C-MYC細(xì)胞核陽(yáng)性(40倍)

圖2 BCL2細(xì)胞膜陽(yáng)性(40倍)

圖3 C-MYC基因易位陽(yáng)性示細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)1個(gè)紅色信號(hào)，1個(gè)綠色信號(hào)，1個(gè)紅綠融合的信號(hào)FISH法×1000

圖4 C-MYC基因多拷貝示細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)>2個(gè)紅綠融合的信號(hào) FISH法×1000

圖5 BCL2基因易位陽(yáng)性示細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)1個(gè)紅色X信號(hào)，1個(gè)綠色信號(hào)，1個(gè)紅綠融合的信號(hào) FISH法×1000

圖6 BCL2基因多拷貝示細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)>2個(gè)紅綠融合的信號(hào) FISH法×1000

1.3熒光原位雜交：根據(jù)HE染色，選擇腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)域作為雜交區(qū)域；C-MYC雙色分離 探針(QP-30-191096)及BCL-2雙色分離探針(QP-30-231029)均購(gòu)自美國(guó)Vysis公司，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。高倍視野記錄100個(gè)腫瘤細(xì)胞核信號(hào)，分離探針正常細(xì)胞顯示兩個(gè)黃色融合信號(hào)緊鄰的兩個(gè)紅綠信號(hào)，基因易位顯示1個(gè)黃色信號(hào)，1紅1綠兩個(gè)分離信號(hào)；拷貝數(shù)增加顯示≥3個(gè)融合信號(hào)。

1.4國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)包括5個(gè)危險(xiǎn)因素：年齡>60歲，乳酸脫氫酶升高，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期，體力狀態(tài)ECOG 2～4分(體力狀態(tài) ECOG：活動(dòng)能力正常，與起病前活動(dòng)能力無(wú)差異0分；能自由的走動(dòng)、從事輕體力活，但不能從事較重的體力活1分；能自由的走動(dòng)，能生活自理，但已喪失工作能力2分；生活尚能部分自理，且一半以上時(shí)間臥床3分；生活不能自理，臥床不起4分)，>1個(gè)部位結(jié)外累及。每項(xiàng)危險(xiǎn)因素各記1分，總分0～1分為低危，2分為低中危，3分為中高危，4～5分為高危。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本研究采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各因素組間差異采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)不滿(mǎn)足χ2檢驗(yàn)條件時(shí)采用 Fisher確切概率法。C-MYC、BCL2蛋白表達(dá)與基因重排及多拷貝的關(guān)系通過(guò)分類(lèi)變量間關(guān)聯(lián)性分析的χ2檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般情況：42例DLBCL中男29例，女13例，男女比例2.23∶1；發(fā)病年齡27～78歲，中位年齡53歲，平均年齡54.5歲；其中GCB型28例，non-GCB型14例；16例乳酸脫氫酶(LDH)升高，26例正常；根據(jù)國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)進(jìn)行危險(xiǎn)度分組：低危組(0～2分)25例，中高危組(3～5分)17例。

2.2蛋白表達(dá)結(jié)果:42例患者均經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)C-MYC、BCL2蛋白表達(dá)。C-MYC、BCL2陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核(圖1)，BCL2陽(yáng)性表達(dá)于胞膜(圖2)，陽(yáng)性部位呈棕褐色、棕黃色或淺黃色。C-MYC蛋白高表達(dá)34例(80.95%)，BCL2蛋白高表達(dá)30例(71.43%)，26例 (61.90%)同時(shí)表達(dá)C-MYC和BCL2蛋白,除去2例DHL，共有24例(57.14%)DEL病例。

2.3基因異常結(jié)果:42例DLBCL中，C-MYC、BCL2基因異常情況見(jiàn)表1。C-MYC基因分離陽(yáng)性及多拷貝見(jiàn)圖3和圖4，BCL2基因分離陽(yáng)性及多拷貝見(jiàn)圖5和圖6。共檢出C-MYC基因易位8例(19.04%)，多拷貝5例(11.90%)；BCL2基因易位5例(11.90%)，多拷貝8例(19.04%)。2例(4.76%)檢測(cè)到C-MYC基因重排合并BCL2基因重排為DHL。2例DHL均起源于生發(fā)中心B細(xì)胞(GCB)，臨床分期均是IV期，IPI指數(shù)均>3，年齡分別為50歲、59歲。1例(2.38%)C-MYC基因多拷貝合并BCL2基因多拷貝，男性，38歲，為非生發(fā)中心B細(xì)胞(non-GCB)，IPI評(píng)分2分。

表1 42例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者C-MYC、BCL2基因易位、多拷貝與各指標(biāo)的關(guān)系

指標(biāo)C-MYC易位(例)是否P值C-MYC多拷貝(例)是否P值BCL2易位(例)是否P值BCL2多拷貝(例)是否P值蛋白表達(dá)0.130 0.950 0.140 0.046 陽(yáng)性826430525822 陰性0817012012年齡0.322 0.982 0.060 0.397 <60歲619322525620 ≥60歲215215019214性別0.686 0.572 0.641 0.686 男623425326623 女211112211211Hans分型0.578 0.178 0.092 0.781 GCB622226523523 NON-GCB212311014311臨床分期0.734 0.039 0.969 Ⅰ～Ⅱ3151170.271 018313 Ⅲ～Ⅳ519420519521ECOG0.140 0.013 0.140 <25294300.954 232529 ≥235173535LDH0.441 0.040 0.969 升高4122140.741 412313 正常422323125521IPI0.542 0.320 0.055 0.116 <3421421124615 ≥3413116413219

2.4基因異常與各指標(biāo)的關(guān)系:BCL2蛋白陽(yáng)性組中共有8例BCL2基因多拷貝，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)；BCL2基因易位與臨床分期、ECOG、LDH的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.039、0.013、0.040)。而C-MYC基因是否易位，是否多拷貝與蛋白表達(dá)、年齡、性別等其他指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

DLBCL在病理形態(tài)、治療反應(yīng)、預(yù)后和分子遺傳學(xué)等方面異質(zhì)性明顯，約三分之二的患者接受初步治療后得到緩解，而其余三分之一的患者復(fù)發(fā)或變得難治性，預(yù)后極差[5]。隨著分子病理的飛速發(fā)展，越來(lái)越多與DLBCL的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療密切相關(guān)分子異常被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，雙重打擊淋巴瘤成為關(guān)注的熱點(diǎn)，并于2016年WHO中將其作為一個(gè)獨(dú)立分類(lèi)，而相當(dāng)比例的復(fù)發(fā)或難治性DLBCL就屬于這一分類(lèi)。鑒于雙重打擊淋巴瘤具有相對(duì)獨(dú)特的臨床特點(diǎn)和不良預(yù)后，故深入研究C-MYC、BCL2基因在DHL的作用對(duì)指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

本研究顯示DLBCL存在著多種分子異常，其中C-MYC基因異常13例(8例基因易位，5例拷貝數(shù)增加)，BCL2基因異常12例(4例基因易位，7例拷貝數(shù)增加，1例易位伴拷貝數(shù)增加)。研究報(bào)道C-MYC基因異常在DLBCL所占比例在4%～14%不等，C-MYC基因易位通常導(dǎo)致C-MYC蛋白的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝、增殖、分化、遷移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。而B(niǎo)CL2重排在DLBCL的檢出率在3.4%-24%，基因重排導(dǎo)致BCL2蛋白表達(dá)，激活BCL2基因的抗凋亡活性[6]。國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI) 被認(rèn)為是衡量患者生存率最重要的預(yù)后因子，也是判斷高?；颊?接受標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法不能獲得長(zhǎng)期緩解)最好的方法。因此，本研究比較 “雙打擊或三打擊”淋巴瘤患者和雙表達(dá)淋巴瘤患者的 IPI 值，間接衡量其預(yù)后區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)BCL2基因易位與臨床分期、ECOG、LDH相關(guān)，臨床分期越晚ECOG評(píng)分越高，LDH升高，BCL2重排率高，提示BCL2基因易位可能與DLBCL的預(yù)后相關(guān)。侵略性B細(xì)胞淋巴瘤中C-MYC和BCL2基因異常主要表現(xiàn)為易位、突變，拷貝數(shù)變化和轉(zhuǎn)錄上調(diào)，偶見(jiàn)兩者合并發(fā)生。本研究檢出2例DHL占4.76%，與國(guó)外研究報(bào)道的0%～12%基本一致。2例DHL年齡分別為50歲和59歲，均起源于生發(fā)中心B細(xì)胞(GCB)，臨床分期均是Ⅳ期，IPI指數(shù)均>3，ki67指數(shù)都在80%，LDH指數(shù)均升高。這與Zeng D等人綜述[5]中DHL患者的中位年齡為51～67歲、有較高臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)升高、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分升高、ki67升高一致。上述結(jié)果表明，DLBCL中存在著復(fù)雜的分子異常改變，從而導(dǎo)致DLBCL異質(zhì)性。

本研究結(jié)果還顯示，42例DLBCL中約有61.90%的DEL病例。多項(xiàng)研究表明, C-MYC和BCL2蛋白共表達(dá)的DLBCL(DEL)預(yù)后差，但優(yōu)于DHL，比DHL更為常見(jiàn)，約占DLBCL的18%～44%不等，以非生發(fā)腫瘤來(lái)源的B細(xì)胞淋巴瘤(non-GCB)居多[2,7-8]。本研究DEL檢出率偏高，可能與選擇性篩選DHL有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)的2例DHL的C-MYC、BCL2蛋白陽(yáng)性率在80%～100%，說(shuō)明蛋白高表達(dá)對(duì)基因異常有一定預(yù)測(cè)，但并不是所有的基因異常均存在蛋白的高表達(dá)，Petrich等人的研究[9]發(fā)現(xiàn)部分DHLs中C-MYC或BCL2蛋白表達(dá)缺失，而此部分患者預(yù)后優(yōu)于DHL。蛋白表達(dá)的缺失可能與C-MYC、BCL2基因重排后進(jìn)一步的變異事件，如C-MYC或BCL2基因易位位點(diǎn)附近發(fā)生了插入或重排，或C-MYC和BCL2基因突變，以及C-MYC非Ig伴侶基因的易位[10-13]，使得現(xiàn)有克隆號(hào)的抗體不能檢出，造成假陰性的結(jié)果。Roth等人利用不同的BCL2抗體在以往檢測(cè)BCL2陰性的標(biāo)本檢出陽(yáng)性[14]就驗(yàn)證了這一點(diǎn)。目前比較公認(rèn)的C-MYC和BCL2蛋白高表達(dá)的閾值(40%和70%)主要是根據(jù)其預(yù)后價(jià)值選擇的，不是作為篩選基因異常閾值[15]，而本研究結(jié)果顯示C-MYC和BCL2的蛋白高表達(dá)與基因易位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明C-MYC和BCL2蛋白高表達(dá)的閾值(40%和70%)難以對(duì)DHL進(jìn)行篩查。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，BCL2蛋白表達(dá)與基因多拷貝差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明基因多拷貝是造成蛋白表達(dá)的另一個(gè)重要因素。Kendrick等研究[16]也表明BCL2基因的擴(kuò)增導(dǎo)致BCL2蛋白表達(dá)。本研究還分析了C-MYC和BCL2基因多拷貝的臨床病理關(guān)系，但并未找到顯著的相關(guān)性。

綜上所述，DLBCL是一類(lèi)異質(zhì)性明顯的疾病，存在著復(fù)雜的分子遺傳學(xué)行為。FISH是診斷DHL的金標(biāo)準(zhǔn)，而目前對(duì)于DHL的最佳治療方案仍未達(dá)成共識(shí)，需要進(jìn)一步深入研究探討其機(jī)理，為臨床治療指明方向。