蒙古國科布多省牛新孢子蟲病PCR診斷初報

吾力江，道爾加拉，郝蘊偉，剛特穆爾，馬鈺，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.蒙古國科布多大學(xué)，科布多，布音特 84000)

犬新孢子蟲(Neosporacaninum)是導(dǎo)致牛流產(chǎn)、死產(chǎn)的主要原因之一，在牛群養(yǎng)殖業(yè)中引起嚴(yán)重的疾病和經(jīng)濟(jì)損失[1]。每年因新孢子蟲引起牛流產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失超過12.983億美元，最高可達(dá)到 23.80億美元，其中 2/3 的損失由乳制品行業(yè)產(chǎn)生，約為 8.429億美元[2-3]。新孢子蟲的感染在很多國家都有報道，然而在蒙古國從未報道。2010年，玄學(xué)南等[4]報道過蒙古羊弓形蟲的ELISA檢測，并未報道檢出新孢子蟲。蒙古國科布多省與新疆青河接壤，兩國之間密切的貿(mào)易往來也可能是導(dǎo)致疾病傳播的原因之一。據(jù)了解，科布多省母畜流產(chǎn)率呈上升趨勢。為調(diào)查科布多省母畜流產(chǎn)是否與新孢子蟲的感染有關(guān)，對新孢子蟲病確診及確定病原種類尤為重要。中國新疆與蒙古國科布多省在“一帶一路”和“上合組織成員國家”長期穩(wěn)定的合作關(guān)系的背景下，中國新疆將草食家畜流產(chǎn)癥防控實踐中成功、成熟的相關(guān)技術(shù)推廣到蒙古國西部省區(qū)草食家畜“母畜流產(chǎn)癥”上。因此，本研究采用PCR診斷方法，對科布多省部分試驗點牛群進(jìn)行新孢子蟲的初步檢測。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2019年1～4月，先后在科布多省2個試驗點進(jìn)行分階段蹲點采集，在布音特蘇木鄉(xiāng)、艾爾登特蘇木鄉(xiāng)、明戈特蘇木牧場等3個檢測點共采集120份牛血樣；所有牛血樣均在EDTA抗凝管中采集，樣品被送往寄生蟲實驗室，并在-20 ℃下儲存直到分析。

1.2 試劑與主要儀器

賽百盛樹脂型TM基因組DNA提純試劑盒購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司，2×TaqPCR Green Mix、DL2000Marker、pMD18-T載體均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 引物合成

在生工生物技術(shù)(上海)有限公司合成了《新孢子蟲檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/P 3499-2013)中規(guī)定的NC-5基因引物，具體反應(yīng)條件和引物序列見表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

引物序列片段大小(bp)退火溫度(℃)循環(huán)條件SN/T 3499FSN/T3499RGGGTGAACCGAGGGAATTCGCCAGTCAACCTACG2315895 ℃/30 s,58 ℃/30 s,72 ℃/30 s,30個循環(huán)

1.4 血液基因組DNA提取、擴(kuò)增及測序

用賽百盛樹脂型TM基因組 DNA提純試劑盒提取牛全血 DNA，放置于-20 ℃冰箱。以提取的DNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 50 μL：2×EsTaqMaster Mix 25 μL，上、下游引物各 2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。用膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，連接pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化到 DH5ɑ 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。次日挑取單個菌落，提取質(zhì)粒；委托生工生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上經(jīng)BLAST比對確定產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果，MEGA 6.0軟件做多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。計算序列間的相似度。從GenBank中下載相關(guān)序列(表2)，以Eimeriatenella為外類群，用鄰近法構(gòu)建NJ樹[5]。

表2 來自Genbank的相關(guān)基因序列

種名宿主來源登錄號序列長度/bp洪氏新孢子蟲(N.hughesi)馬美國CF937166.1531美國CB831689.1636美國CB831693.1484美國CB831816.1620美國CB831888.1373美國CD667672.1424美國CF350036.1510美國CF937166.1531犬新孢子蟲(N.caninum)奶牛波蘭EF463098.1336奶牛新西蘭AY459289.1350裸鼠瑞士X84238.11205兔英國EU686398.1227綿羊英國DQ077663.1227柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)雞美國BI895222.1477

2 結(jié)果

2.1 新孢子蟲NC-5基因PCR擴(kuò)增

對所提取的120份牛血樣DNA 進(jìn)行了PCR檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，得到231 bp的特異性目的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。120份樣品中，9份呈陽性，總感染率為7.5%(9/120)；布因特蘇木鄉(xiāng)感染率為2.8%(1/35)；明戈特蘇木牧場感染率為3.3%(1/30)；艾爾登特蘇木鄉(xiāng)感染率為12.7%(7/55)，在3個檢測點里感染率最高。

2.2 序列分析

PCR擴(kuò)增牛血樣DNA，NC-5序列長度為231 bp，與預(yù)期目的片段長度相符。經(jīng)測序和DNAMAN比對，去除兩端部分可變堿基后，獲得了226個堿基；本試驗所得到的新孢子蟲序列(N.caninumWLJ)與新孢子蟲(GenBank登錄號：EF463098.1、AY459289.1、X84238.1、EU686398.1、DQ077663.1)的序列堿基相似度高達(dá)99.05%(圖2)。

注：M.DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.被檢樣品；2.陰性對照

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

注：深藍(lán)代表堿基全部相同、淺藍(lán)代表堿基1/2相同，紅色代表堿基3/4相同。

圖2 NC-5序列同源性比較

2.3 新孢子蟲NC-5 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于NC-5序列的NJ樹(圖3)顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹中新孢子蟲屬分為兩大支，其中，N.hughesi單獨聚為一支，N.caninum聚為一支，置信度為91%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NC-5與GenBank 上下載的EU686398.1 構(gòu)成一個自展值為99% 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分支。

3 討論

科布多省位于蒙古西南邊疆，東面與扎布汗省和戈壁阿爾泰省相接，北面與烏布蘇省相連，西面與巴彥烏列蓋省為鄰，南面和西南面同我國新疆維吾爾自治區(qū)接壤。新疆是連通歐亞大陸的重要樞紐，是第二座“亞歐大陸橋”的必經(jīng)之地，是與“一帶一路”沿線國家進(jìn)行貿(mào)易往來的重要門戶。蒙古國科布多省與中國新疆接壤，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒙古國與中國新疆接壤處常常有母畜流產(chǎn)發(fā)生。歐洲[7]、亞洲[8]、蒙古國以南的俄羅斯報道了衣原體導(dǎo)致的山羊流產(chǎn)[9]，而蒙古國以北的中國新疆報道了新孢子蟲導(dǎo)致的牛羊流產(chǎn)情況[10-11]。蒙古國對新孢子蟲病的研究仍處于空白。蒙古國是畜牧業(yè)大國，代代以草原畜牧業(yè)為主，依靠草原畜牧業(yè)提供的肉、乳等畜產(chǎn)品；蒙古國的牛群飼養(yǎng)量約為488.28萬頭，位居綿羊數(shù)量之后第二位，牛群出現(xiàn)頻繁流產(chǎn)導(dǎo)致養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)迅速下降。因此，本研究通過新孢子蟲病的PCR檢測，探究科布多省牛群流產(chǎn)是否與新孢子蟲的感染有關(guān)。

圖3 基于NC-5基因序列構(gòu)建的鄰接法(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹

采用PCR方法，針對新孢子蟲NC-5基因檢測對血液、腦組織內(nèi)蟲體敏感性較好，故作為本試驗的診斷引物。本試驗對隨機(jī)采集的120份牛血DNA進(jìn)行新孢子蟲的PCR檢測，新孢子蟲陽性率為7.5%(9/120)，確定了牛群中新孢子蟲的存在。經(jīng)測序，科布多省牛新孢子蟲NC-5株與GenBank上的英國株、瑞士株、新西蘭株同源性達(dá)99%，其序列相似性為95.13%，有個別堿基的差異，因此推測它們之間存在一定的進(jìn)化關(guān)系。

蒙古國科布多省牛群以散養(yǎng)為主，牧民家里飼養(yǎng)牧羊犬，這可能是導(dǎo)致新孢子蟲感染牛群的原因。因此減少病原體傳播是防控牛流產(chǎn)的最有效的方法之一。

本文初次報道科布多省牛群感染新孢子蟲，填補(bǔ)了蒙古國新孢子蟲研究的空白，為后續(xù)新孢子蟲病的防控研究提供了基礎(chǔ)資料。