對(duì)在注射劑研發(fā)過程中無(wú)菌檢查的思考

徐興魯 邢立超 王少鵬 王 丹

山東新創(chuàng)生物科技有限公司 山東 濟(jì)南250000

注射劑系指藥物制成的供注入體內(nèi)的無(wú)菌溶液以及供臨用前配成溶液或混懸液的無(wú)菌粉末或濃溶液，作為藥品的一種重要?jiǎng)┬捅粡V泛地應(yīng)用于臨床，由于其直接注入人體體內(nèi)，發(fā)揮療效，因此其安全性顯得更為重要。無(wú)菌檢查是體現(xiàn)滅菌效果的主要手段，也是注射劑質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)。

無(wú)菌檢查法一般分為兩種方法：直接接種法和薄膜過濾法。直接接種法即每支(或瓶)供試品按規(guī)定量分別接入含培養(yǎng)細(xì)菌及真菌培養(yǎng)基的容器中。薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可用一般薄膜過濾器。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑為0.45μm，直徑約為50 mm。根據(jù)供試品及溶劑的特性選擇濾膜的材質(zhì)。如抑菌性供試品采用具有疏水性邊緣及低吸附性的濾膜。濾器及濾膜采用適宜的方法滅菌；使用時(shí)，要保證濾膜的完整性；水溶性供試品，先用少量沖洗液濕潤(rùn)濾膜。油類供試品，濾膜和濾器，在使用前應(yīng)充分干燥，備用。過濾時(shí)，保持供試液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面；沖洗濾膜時(shí)，每張濾膜每次沖洗量為100 ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法與方法驗(yàn)證相同。

方法驗(yàn)證：1.薄膜過濾法是將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。取一支裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量的試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌同法操作。2.直接接種法是指取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支，分別接入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的菌懸液1 ml(含菌小于100 cfu)各兩管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液1ml(含菌小于100 cfu)各兩管。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為陽(yáng)性對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天。與陽(yáng)性對(duì)照比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，可按此法進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，增加培養(yǎng)基的用量，使用中和劑如β-內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸、聚山梨脂80等，更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

下面談一下在藥物研發(fā)過程中遇到問題的思考：

1.樣品取樣量方面：檢驗(yàn)數(shù)量是指一次檢驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量；檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量。檢驗(yàn)量的表格不包括陽(yáng)性對(duì)照用的用量，雖然有專門說明，但仍容易忽略。無(wú)菌檢查應(yīng)保證檢驗(yàn)數(shù)量以使試驗(yàn)結(jié)果具有代表性；而陽(yáng)性對(duì)照和驗(yàn)證試驗(yàn)滿足檢驗(yàn)量總量要求即可以檢驗(yàn)樣品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，即保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.樣品處理方面：注射劑有不同劑型，對(duì)于注射液還比較好過濾，但對(duì)于其他劑型要注意處理方式。如粉針劑，要關(guān)注固體樣品的溶解、轉(zhuǎn)移、均勻分配問題，通常將規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到500 ml稀釋劑或適宜溶液中，再進(jìn)行分配。在對(duì)可溶于十四烷酸異丙酯的油類供試品進(jìn)行處理時(shí)，無(wú)菌的十四烷酸異丙酯用量需經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。3.培養(yǎng)基與菌種方面：做無(wú)菌實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查是很有必要的，培養(yǎng)基的適用性檢查包括培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查和培養(yǎng)基的靈敏度檢查，以確保初步環(huán)節(jié)可靠。驗(yàn)證用菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，中檢所老師要求應(yīng)加上大腸埃希菌，一共七株菌，對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證；由于使用頻繁，對(duì)菌種的要求為不得超過5代，采用適宜的方法保存；加菌量應(yīng)小于100cfu，一般100cf u比較合適，過多過少均影響判斷結(jié)果。有的申報(bào)資料中未提供試驗(yàn)菌的濃度，這一點(diǎn)往往被忽視。4.操作方法方面：直接接種法取樣量少，方法繁瑣，且易受外源性細(xì)菌污染，對(duì)操作者和操作環(huán)境要求高，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大。薄膜過濾法采用大取樣量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作簡(jiǎn)單。該系統(tǒng)是全封閉過濾系統(tǒng)，避免了操作過程中外源性細(xì)菌的污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性影響較小。取樣量大于5 ml/支直接接種法不再適用，發(fā)展趨勢(shì)采用全封閉的薄膜過濾法。

5.快速無(wú)菌檢查法：開展快速無(wú)菌檢測(cè)技術(shù)研究的意義在于，傳統(tǒng)無(wú)菌試驗(yàn)至少耗時(shí)14天，對(duì)有效期短的產(chǎn)品，如體細(xì)胞治療產(chǎn)品、基因治療產(chǎn)品等，以及生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品、原液及半成品快速的使用，縮短生產(chǎn)周期，在較短的時(shí)間之內(nèi)放行和使用。