基于OBE理念的藥物化學(xué)生物學(xué)實驗教學(xué)案例設(shè)計

黃 瑾，徐仲玉，岳嶺佳

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237）

0 引 言

成果導(dǎo)向教育理念（Outcomce Based Education，OBE）自1981 年提出以來便得到了教育工作者的廣泛重視與認(rèn)可，已成為歐美等發(fā)達(dá)國家教育改革的主流理念，其以產(chǎn)出為導(dǎo)向，要求學(xué)生具備分析和解決復(fù)雜問題的能力、創(chuàng)新意識和團(tuán)隊合作精神。新形勢下我國藥學(xué)專業(yè)高等教育的任務(wù)是培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和實踐能力的高級藥學(xué)專門人才，其中創(chuàng)新以知識為基礎(chǔ)，思想為關(guān)鍵，實踐為根本。藥物化學(xué)生物學(xué)是現(xiàn)代化學(xué)與生命科學(xué)交叉產(chǎn)生的新興學(xué)科，通過使用化學(xué)小分子干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展的過程，為發(fā)現(xiàn)新藥提供理論依據(jù)［1-3］，是新形勢下本科藥學(xué)專業(yè)的核心課程，這一課程對知識、思想和實踐的綜合強(qiáng)化與當(dāng)前主流教育理念和培養(yǎng)目標(biāo)不謀而合。目前，我校藥學(xué)專業(yè)已開設(shè)了藥物化學(xué)生物學(xué)課程。為契合培養(yǎng)具有扎實的藥學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)知識和藥學(xué)實踐能力的培養(yǎng)目標(biāo)，體現(xiàn)從基因到藥物，理工結(jié)合、教研結(jié)合的專業(yè)特色，及時跟蹤學(xué)科發(fā)展的最新成果，將科研成果及科研心得引入教學(xué)實踐中，完善更新藥物化學(xué)生物學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容［4］。

從分子水平上詳細(xì)了解并闡明小分子藥物與靶蛋白的相互作用，是現(xiàn)代藥物化學(xué)生物學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。該研究有助于更加深入、清晰地認(rèn)識各種藥物在生物體內(nèi)的藥理活性及其作用方式，同時也可為篩選藥效更顯著、毒副作用更小的新型藥物提供科學(xué)依據(jù)［5］。

小分子化合物與靶標(biāo)蛋白相互作用的識別是開發(fā)靶向候選藥物的一個重要起點［6］，蛋白質(zhì)熱漂移實驗（Protein Thermal Shift Assay，TSA），也叫差示掃描熒光檢測實驗（Differential scanning fluorimetry，DSF），是檢測目標(biāo)蛋白熱穩(wěn)定性的熱變性實驗，也是一種經(jīng)濟(jì)實用、方便快捷確證活性小分子與靶蛋白相互作用的實驗手段。不同小分子化合物對蛋白的熱穩(wěn)定性影響不同［7］，通過TSA法檢測加入小分子化合物后靶標(biāo)蛋白熔解溫度的變化（ΔTm），可判斷小分子化合物對蛋白的作用強(qiáng)弱，進(jìn)而篩選出可有效結(jié)合靶蛋白的小分子化合物［8］。

1 蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移法

1.1 實驗原理

蛋白的Tm值（熔解溫度）對確定蛋白的結(jié)構(gòu)特征、穩(wěn)定性及蛋白-配體間相互作用具有重要意義。配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，通常能增強(qiáng)靶標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，使靶標(biāo)蛋白的Tm值發(fā)生改變（ΔTm）。Tm值的改變源于配體與受體蛋白間的結(jié)合能（ΔGbind），可通過蛋白質(zhì)熱漂移實驗進(jìn)行測定［9］，其原理如圖1 所示。

通常蛋白質(zhì)處于一種折疊的狀態(tài)，其疏水部分藏于蛋白內(nèi)部。SYPRO Orange 是一種在水溶液中幾乎不發(fā)光、與蛋白疏水性表面結(jié)合后可產(chǎn)生熒光的染料分子［10］。當(dāng)目標(biāo)蛋白所處溶液體系溫度緩慢升高時，目標(biāo)蛋白隨溫度升高解開折疊并逐漸暴露出疏水表面，疏水表面非特異性地結(jié)合SYPRO Orange 染料，導(dǎo)致體系熒光信號強(qiáng)度上升。當(dāng)溫度達(dá)到某一臨界點時，展開的蛋白質(zhì)鏈聚集，阻止熒光染料結(jié)合，被阻止的熒光染料重新回到周圍的水環(huán)境中，導(dǎo)致高溫下熒光淬滅，熒光信號強(qiáng)度下降。通過檢測體系中熒光信號的變化，可得出目標(biāo)蛋白的熔解曲線，并計算出蛋白的Tm值（Tm值為熔解曲線增色效應(yīng)達(dá)到最大值一半時的溫度）。加入化合物后若目標(biāo)蛋白的Tm值出現(xiàn)明顯增加（一般升高至少2 ℃以上），則說明該化合物能與目標(biāo)蛋白結(jié)合并穩(wěn)定其構(gòu)象［11］，如圖2 所示。

圖1 配體誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化示意圖

圖2 蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移法原理

2 實驗內(nèi)容

2.1 實驗材料、主要試劑與儀器

2.1.1 實驗材料

法尼醇X 受體的羧基末端配體結(jié)合區(qū)（FXRLBD）（北京百諾威生物科技有限公司），96 孔定量PCR板（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。

2.1.2 實驗試劑

SYPRO Orange 5000X（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），鹽酸小檗堿Berberine Hydrochloride（上海詩丹德有限公司），伊維菌素Ivermectin（上海詩丹德有限公司），Tris-Hcl（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），NaCl（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙二胺四乙酸EDTA（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），二硫蘇糖醇DTT（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），二甲基亞砜DMSO（上海泰坦科技有限公司）。

2.1.3 實驗儀器

熒光實時定量PCR 儀（Bio-Rad 上海有限公司），Eppendorf移液器（艾本德（中國）股份有限公司）。

2.2 實驗操作流程

TSA實驗主要是在96 孔定量PCR板中利用熒光實時定量PCR 儀完成平行檢測。實驗反應(yīng)體系相對簡單，包括蛋白緩沖液，蛋白質(zhì)樣品，SYPRO Orange以及配體化合物。實驗的具體操作流程如圖3 所示。

圖3 蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移法的實驗操作流程

2.3 樣品溶液配置

以穩(wěn)定性較高的代謝類疾病重要靶標(biāo)法尼醇X受體FXR為目標(biāo)蛋白，分別選擇無活性的鹽酸小檗堿（Berberine Hydrochloride）及高活性的伊維菌素（Ivermectin）［12］兩種化合物開展實驗，用二甲基亞砜（DMSO）配置成5 mmol/L 的化合物母液備用。按以下比例配置實驗所需的活性測試液（10 mmol/L Tris，10 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，pH 8.0）50 mL，0.22 μm 濾膜過濾后備用，用活性測試液將熒光染料SYPRO Orange稀釋1000 倍待用。將實驗樣品分為3 組，一組空白組（檢測蛋白本身的Tm值）以及兩個化合物組，每組設(shè)置3 個平行。為減少同一樣品的測試誤差，可將3 個平行孔的染料、蛋白和化合物預(yù)先在1.5 mL 離心管中配制混合液150 μL，包括已稀釋好的染料溶液141 μL，化合物1.5 μL（終濃度為50 μmol/L），以及蛋白7.5 μL（終濃度5 μmol/L），按40 μL/孔分裝到PCR 板內(nèi)用封條把PCR 板封緊，在4 ℃條件下1 000g，離心2 min 使孔內(nèi)無氣泡，再放入Bio-Rad CFX96 型RT-PCR儀中。

2.4 PCR程序設(shè)置

在熒光實時定量PCR 儀上打開Bio-Rad 軟件，新建一個測試程序，在新程序中插入Melt Curve，調(diào)整溫度檢測范圍為25 ～90 ℃，每18 s上升0.3 ℃，調(diào)整樣品體積的參數(shù)為40 μL。點擊next，選擇Edit Selected，將Scan Mode改為Fret；點擊next，然后對準(zhǔn)孔槽放入樣品，關(guān)上蓋子，啟動程序。

2.5 結(jié)果分析

在實驗原理部分已知通過實時監(jiān)測熒光信號即可以觀察到蛋白的熱穩(wěn)定性狀態(tài)。如果蛋白結(jié)合某一化合物后Tm值發(fā)生變化，當(dāng)ΔTm升高2 ℃以上時，表明該化合物對受體蛋白有結(jié)合。在Bio-Rad 軟件程序運(yùn)行結(jié)束后，軟件會自動分析直接可得到蛋白的Tm值。由圖4 可以看到，只有陽性化合物伊維菌素顯著提高了FXR-LBD的熱穩(wěn)定性，鹽酸小檗堿對FXR-LBD 的熱穩(wěn)定性無影響。

圖4 伊維菌素對FXR-LBD熔解溫度的影響

為進(jìn)一步探索化合物濃度對蛋白穩(wěn)定性的影響，將伊維菌素用DMSO配置成不同濃度，使其在體系中終濃度分別為1、10、25、50、100 μmol/L，用上述方法分別測定不同濃度的伊維菌素對FXR-LBD 蛋白熔解曲線的影響，計算得到Tm值，如圖5 所示。檢測結(jié)果顯示，隨著化合物濃度的增高，蛋白的熱穩(wěn)定性升高。

圖5 不同濃度的伊維菌素對FXR-LBD的熱穩(wěn)定性的影響

3 實驗注意事項

從實驗溶液配制分裝技巧、體系中顆粒和細(xì)菌控制以及平行操作3 個角度總結(jié)了整個實驗需要注意的事項。

實驗操作中溶液的配制和分裝是重要環(huán)節(jié)，溶液的混勻操作對整個實驗的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。實驗中涉及多管反應(yīng)配制混合液，可先將各組分在1.5 mL EP管中混合均勻后再分裝到96 孔定量PCR 板中；涉及濃度梯度稀釋時，務(wù)必將高濃度溶液混合均勻后再進(jìn)行稀釋。

反應(yīng)溶液中的顆粒和細(xì)菌會對測試體系的澄清度及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性造成影響，從而影響整個實驗的準(zhǔn)確性，故實驗過程中用到所有溶液，配制完成后均須用0.22 μm的濾頭過濾，除去不溶性顆粒物及細(xì)菌，方能使用［13］。為了避免不同體系交叉污染，實驗過程中所用的槍頭，96 孔板，離心管等均為一次性使用，切勿重復(fù)利用。

為了提高實驗結(jié)果的可靠性，每組樣品設(shè)置至少3 個復(fù)孔及未加入化合物的陰性對照，對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格校正以消除誤差［14］。設(shè)置陰性對照可幫助準(zhǔn)確判斷實驗中所用的蛋白，染料，緩沖液等是否變質(zhì)，避免因?qū)嶒烍w系污染產(chǎn)生的錯誤實驗結(jié)果。

4 教學(xué)討論

本實驗項目有較強(qiáng)的連貫性和綜合性，且實驗成本較低，受眾面較廣，適合作為藥物化學(xué)生物學(xué)實驗教學(xué)環(huán)節(jié)的綜合性實驗開設(shè)。不同于基礎(chǔ)性驗證實驗，熱穩(wěn)定性檢測靶標(biāo)蛋白與小分子化合物的相互作用模擬了一個小型研究課題，整體實驗設(shè)計以學(xué)生為主，讓學(xué)生以小組協(xié)作形式自行設(shè)計實驗細(xì)節(jié)及操作實驗，給予學(xué)生更多的自主空間，團(tuán)隊協(xié)作討論，充分激發(fā)學(xué)生的主觀能動性和團(tuán)隊協(xié)作精神。在實驗結(jié)束后，師生一起對實驗過程中出現(xiàn)的問題及實驗結(jié)果進(jìn)行討論和點評，使學(xué)生進(jìn)一步系統(tǒng)全面地掌握科研中常用的蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移法實驗，對培養(yǎng)學(xué)生的藥物創(chuàng)新思維、團(tuán)隊協(xié)作精神提高科研能力具有重要的意義［15］。

在本實驗過程中熔解曲線可能會出現(xiàn)如下問題，經(jīng)過師生討論進(jìn)行了進(jìn)一步的拓展：① 無熔解曲線：并非所有蛋白質(zhì)都能在熱變性時有理想的熔解圖譜，約15% ～20%的重組蛋白沒有理想的變性曲線，其常見的原因包括：蛋白本身缺乏緊密的球形折疊，缺少疏水核心或在室溫下穩(wěn)定性差，熱遷移實驗不適用于檢測存在以上情況的靶標(biāo)蛋白質(zhì)與化合物的相互作用分析。②熔解曲線不光滑：在蛋白質(zhì)熱遷移的實驗過程中，緩沖液溫度會緩慢上升，實驗前應(yīng)提前明確蛋白緩沖液隨溫度升高pH 值變化的情況［16-17］，需選擇溫度升高對測試體系pH 值影響較小的緩沖液條件。此外，還可以通過改變一些參數(shù)來改變?nèi)劢馇€不光滑的情況，如SYPRO Orange染料的濃度，緩沖液的配方及蛋白的濃度等，尋找目標(biāo)蛋白最佳熔解曲線測試條件。③熔解曲線出現(xiàn)多個峰：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含有不止一個結(jié)構(gòu)域或形成低聚物時，熔解曲線可能會出現(xiàn)多個峰，這時不能準(zhǔn)確得到蛋白的熔解溫度?？赏ㄟ^改變緩沖液，確定蛋白的展開條件。也可獲取靶標(biāo)蛋白單獨(dú)的活性結(jié)構(gòu)域再使用蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移法進(jìn)行相關(guān)測試。

5 結(jié) 語

本實驗從我校理工結(jié)合、教研結(jié)合的專業(yè)特色出發(fā)，以O(shè)BE教育理念為導(dǎo)向，從培養(yǎng)目標(biāo)達(dá)成角度分析，將科研中常用的蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移技術(shù)設(shè)計導(dǎo)入藥物化學(xué)生物學(xué)實驗教學(xué)環(huán)節(jié)，把科研成果引進(jìn)藥學(xué)本科課堂教學(xué)［18］，通過科研反哺教學(xué)。學(xué)生通過小組協(xié)作自主實驗觀察加入伊維菌素和鹽酸小檗堿兩種不同化合物后，F(xiàn)XR-LBD蛋白的熔解曲線的變化，判斷小分子化合物對蛋白作用的強(qiáng)弱。整個實驗過程既有利于藥學(xué)專業(yè)本科生理解并掌握小分子與蛋白相互作用的相關(guān)藥物化學(xué)生物學(xué)知識，也有利于同學(xué)們了解藥物化學(xué)生物學(xué)學(xué)科的前沿動態(tài)，還可激發(fā)學(xué)生們的學(xué)習(xí)積極性以及創(chuàng)新精神，培養(yǎng)團(tuán)隊協(xié)作精神，切實為培養(yǎng)具有藥物創(chuàng)新意識、團(tuán)隊協(xié)作精神，能在新藥創(chuàng)制領(lǐng)域從事各類科研開發(fā)管理等工作的人才培養(yǎng)目標(biāo)服務(wù)。