n-3多不飽和脂肪酸對(duì)克羅恩病大鼠模型的干預(yù)效果及腸道微生態(tài)菌群的影響*

叢龍玲，姚嘉茵，呂永慧△，胡邦，詹原泉

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃科 廣東廣州 510130

2 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東廣州 510655

3 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院肛腸外科 廣東廣州 510655

克羅恩?。–rohn’s disease，CD）是一種可以累及全消化道的腸道慢性炎癥，具有緩解期與活動(dòng)期交替反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。慢性炎癥不斷進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致穿孔、腸瘺、腹腔膿腫及腸梗阻等并發(fā)癥，37%～61%的CD患者在確診后10年內(nèi)因?yàn)槌霈F(xiàn)并發(fā)癥而需要接受一次或以上的手術(shù)治療[1]。目前，CD的發(fā)病機(jī)制不明確，有觀點(diǎn)認(rèn)為CD是在易感人群遺傳背景下發(fā)生的與感染密切相關(guān)的腸道免疫功能紊亂[2]，缺乏有效治療藥物。近期對(duì)CD的研究[3]更關(guān)注于飲食以及腸道微生態(tài)菌群在CD發(fā)病機(jī)制中的作用。作者團(tuán)隊(duì)既往研究已證實(shí)，n-3多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3PUFA）要素飲食可有效改善三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的CD大鼠模型的腸組織病理學(xué)改變，下調(diào)血清炎性因子表達(dá)水平，對(duì)CD大鼠有確切的治療作用[4]，但關(guān)于n-3PUFA對(duì)大鼠動(dòng)物模型腸道微生態(tài)菌群的影響尚未明確。因此，本研究擬使用HLAB27轉(zhuǎn)基因大鼠（以下簡(jiǎn)稱B27大鼠）作為CD動(dòng)物模型，HLA-B7轉(zhuǎn)基因大鼠作為對(duì)照組，采用n-3PUFA作為干預(yù)治療，探討n-3PUFA飲食對(duì)CD腸道微生態(tài)的影響，以及與CD疾病活動(dòng)和炎性因子表達(dá)變化的關(guān)系，以期為研發(fā)有效且低毒副作用的CD治療用藥提供一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本研究采用HLA-B7轉(zhuǎn)基因大鼠（B7大鼠，n=8）以及HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠（B27大鼠，n=16），所有轉(zhuǎn)基因大鼠均購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重180～220 g。飼養(yǎng)在25℃室溫，相對(duì)濕度55%±10%，晝夜12 h/12 h環(huán)境下，所有大鼠自由攝水。B27大鼠表達(dá)人主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類HLAB27基因及相關(guān)的人β2-微球蛋白基因，出現(xiàn)全胃腸道炎癥，作為模型大鼠。B7大鼠不出現(xiàn)腸道炎癥，作為對(duì)照。B27大鼠隨機(jī)分為模型組與治療組，故大鼠分組如下：空白對(duì)照組（B7，n=8）；模型組（B27，n=8）以及治療組（B27+n-3PUFA，n=8）。治療組通過(guò)灌胃方式給予n-3PUFA飲食干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為2周，每天灌胃一次。根據(jù)公式：大鼠有效干預(yù)劑量=（X mg/kg×70 kg×0.018）/0.2 kg，即6.3X mg/kg，其中X代表人的有效干預(yù)劑量，換算大鼠干預(yù)劑量得20 mg/（kg· d）[5]。

1.2 大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

每日記錄各組大鼠的一般資料，包括大便情況、體重變化。根據(jù)疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）[6]評(píng)估各組大鼠腸炎疾病活動(dòng)度。體重下降（分值：無(wú)=0；1%～5%=1；6%～10%=2；11%～15%=3；＞15%=4）、糞便性狀（分值：正常=0；半稀便=2；稀便=4）、大便隱血（分值：陰性=0；陽(yáng)性=2；肉眼血便=4）三項(xiàng)評(píng)分相加為DAI評(píng)分，評(píng)分越高提示疾病活動(dòng)度越高。

1.3 大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷及組織學(xué)損傷指數(shù)評(píng)分

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，麻醉大鼠后處死，取新鮮結(jié)腸組織，觀察大體損傷情況，評(píng)估結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù) （colon macroscopic damage index，CMDI），分值如下[5]：正常=0；局部黏膜充血水腫=1；線性潰瘍=2；線性潰瘍+黏膜炎癥=3；2個(gè)以上部位出現(xiàn)線性潰瘍=4；縱型潰瘍長(zhǎng)度＞1 cm=5；潰瘍長(zhǎng)度＞2 cm=6～8。

結(jié)腸組織經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察，評(píng)估組織學(xué)損傷指數(shù)（tissue damage index，TDI）[6]，分值如下：無(wú)損傷=0；黏膜及黏膜下炎癥浸潤(rùn)/輕度糜爛=1；1分基礎(chǔ)上病變范圍＞50%=2；潰瘍延伸至黏膜下層和黏膜肌層=3；3分基礎(chǔ)上病變范圍＞50%=4；細(xì)胞壞死達(dá)黏膜固有基層=5；5分基礎(chǔ)上病變范圍＞50%=6。

1.4 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清炎性因子表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠麻醉后心臟穿刺取血（2～3 mL），離心（2 000 r/min×5 min）后得血清，進(jìn)行ELISA（試劑盒購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)的因子包括促炎因子（IL-17、IL-2）以及抑炎因子（IL-10、IL-4）。

1.5 16S rRNA基因組檢測(cè)糞便微生態(tài)狀況

留取新鮮糞便，均勻混勻后取樣，置于滅菌離心管中（樣品＞20 g/樣），液氮速凍，-80℃存放。使用2-250-bp末端配對(duì)reads對(duì)16S rRNA基因的V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序（MiSeq，Illumina，Essex，UK）。利用UPARSE在97%相似度下進(jìn)行聚類，得到OTU（operational taxonomic units，操作分類單元）的代表序列；使用usearch_global方法將所有Tags比對(duì)回OTU代表序列，得到每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表，通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8，完成OTU的物種分類。本研究采用Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行α多樣性（Alpha diversity）分析。采用Bray-Curtis指數(shù)進(jìn)行β多樣性（Beta diversity）分析，應(yīng)用基于Bray-Curtis進(jìn)行非度量多維尺度法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）對(duì)比樣本組之間差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0（IBM公司，美國(guó)）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；符合偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（QL，QU）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，兩兩組間比較采用Kruskal-Wallis Oneway ANOVA（k samples）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組DAI、CMDI、TDI評(píng)分

B27大鼠的DAI評(píng)分高于B7大鼠（P＜0.05），采用n-3PUFA干預(yù)后，B27大鼠DAI評(píng)分有下降趨勢(shì)。進(jìn)一步采用量表評(píng)估大體組織損傷程度以及鏡下病變程度，結(jié)果提示B27大鼠存在明顯的腸組織器官損傷（P＜0.05），采用n-3PUFA干預(yù)后，鏡下?lián)p傷得以改善（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組DAI、CMDI以及TDI評(píng)分 分，M（QL，QU）

圖1 各組大鼠結(jié)腸病理學(xué)所見（HE）

2.2 各組炎性因子的表達(dá)水平

與B7組大鼠比較，B27組大鼠促炎因子（IL-17、IL-2）表達(dá)升高，抑炎因子（IL-10、IL-4）表達(dá)下降（均P＜0.05），提示B27大鼠存在炎性因子的表達(dá)失衡。采用n-3PUFA干預(yù)后，可抑制B27大鼠促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子的表達(dá)（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組炎性因子的表達(dá)水平 pg/mL，±s

表2 各組炎性因子的表達(dá)水平 pg/mL，±s

*與B7組比較，P＜0.05；#與B27組比較，P＜0.05。

指標(biāo)IL-17 IL-2 IL-10 IL-4 B7 32.6±11.4 13.9±8.6 22.4±7.1 71.8±11.0 B27 73.5±11.2*42.4±17.5*11.9±7.7*30.3±6.4*B27+n-3PUFA 39.3±16.7#18.0±8.0#21.8±3.2#46.6±8.8#*

2.3 n-3PUFA干預(yù)后對(duì)B27大鼠糞便微生態(tài)菌群的影響

已知B27大鼠腸道微生物菌群的表型與CD相似，采用n-3PUFA干預(yù)B27大鼠模型，在干預(yù)前后留取大鼠新鮮糞便，行16S rRNA測(cè)序，并進(jìn)一步完成α多樣性（Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，圖2A、圖2B）分析以及β多樣性（基于Bray-Curtis進(jìn)行NMDS分析，圖2C）分析，結(jié)果提示n-3PUFA治療后B27大鼠糞便菌群的豐富性以及多樣性增加。

圖2 n-3PUFA干預(yù)前后對(duì)HLA-B27大鼠糞便微生態(tài)菌群的影響

3 討論

HLA-B27大鼠是一種自發(fā)出現(xiàn)包括回腸在內(nèi)的全消化道慢性炎癥動(dòng)物模型，其腸道微生態(tài)菌群的改變類似CD患者的改變[7]。因此，該動(dòng)物模型目前主要用于腸道微生態(tài)菌群研究。本研究中使用HLAB27大鼠作為CD模型大鼠，鑒于HLA-B7大鼠不會(huì)出現(xiàn)腸道炎癥[8]，故作為對(duì)照組。

要素飲食是治療CD的重要手段。臨床上對(duì)于合并腸瘺、腸梗阻等并發(fā)癥的CD、難治性CD或者兒童CD患者，使用全腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持治療（exclusive enteral nutrition，EEN），可以有效促進(jìn)黏膜愈合，降低手術(shù)率[9]。其機(jī)理可能與減少飲食攝入的食物抗原，從而減輕腸道免疫反應(yīng)相關(guān)。脂肪酸是人體重要的必需營(yíng)養(yǎng)素，其中n-3PUFA被報(bào)道具有抗炎、抗氧化的作用。我們前期研究已證實(shí)n-3PUFA可有效治療TNBS誘導(dǎo)的CD大鼠[4]，但是n-3PUFA對(duì)B27大鼠的干預(yù)作用和對(duì)微生物生態(tài)群落的影響卻未知。本研究結(jié)果提示，n-3PUFA可有效改善B27大鼠結(jié)腸組織學(xué)病理，但對(duì)大體病變及臨床活動(dòng)度的治療作用不明顯，這可能和飲食干預(yù)時(shí)間有限相關(guān)。

免疫紊亂一直是CD致病機(jī)制研究中的焦點(diǎn)，炎性指標(biāo)的表達(dá)可以反映免疫反應(yīng)水平。在免疫相關(guān)性疾?。ū热鐝?qiáng)直性脊柱炎[10]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[11]等）中炎性指標(biāo)出現(xiàn)表達(dá)失衡，表現(xiàn)為促炎因子表達(dá)增加，抑炎因子表達(dá)減少。本研究結(jié)果提示B27大鼠血清中促炎因子（IL-17、IL-2）表達(dá)增加，抑炎因子（IL-10、IL-4）表達(dá)減少，腸道慢性炎癥持續(xù)反應(yīng)導(dǎo)致器官損傷。n-3PUFA干預(yù)后有效糾正炎性因子失衡，提示n-3PUFA一定程度上可減輕腸道免疫反應(yīng)。

腸道微生態(tài)中包括1 000～1 150種細(xì)菌，1014個(gè)總細(xì)胞數(shù)，占據(jù)人體總微生物的78%，由此認(rèn)為腸道微生態(tài)本身就是一個(gè)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，甚至是一個(gè)具有多種功能的微器官[12]。腸道微生態(tài)與人類多種疾病息息相關(guān)，比如肥胖癥等代謝性疾病、CD等免疫性疾病等[13]。2016年Ianiro等[14]在Gut雜志報(bào)道，CD患者腸道菌群多樣性下降，各細(xì)菌菌屬豐度改變，包括變形菌門（Proteobacteria）增加，厚壁菌門（Fir?micutes）減少，擬桿菌屬（Bacteroides）、優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）和乳桿菌屬（Lactobacillus）等有益菌群顯著減少，機(jī)會(huì)致病菌屬增加。2017年Halfvarson等[15]發(fā)現(xiàn)不同IBD亞型的腸道微生物組特點(diǎn)不同，均與健康人群有顯著差異，此外，CD相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)變異將影響腸道微生物菌群。糞菌移植（fecal micro?biota transplantation，F(xiàn)MT）通過(guò)改變腸微生態(tài)菌群可以安全有效治療CD患者的復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染[16-17]。因此，微生態(tài)菌群在CD致病中起重要作用，致力于研究并且阻斷CD致病中的微生態(tài)改變，有可能成為治療CD的有效手段。本研究結(jié)果提示，n-3PUFA可以增加B27大鼠腸道微生態(tài)的豐富性以及多樣性，這可能是n-3PUFA治療克羅恩病大鼠的機(jī)制之一。

本研究驗(yàn)證了n-3PUFA飲食對(duì)B27大鼠的治療作用，這可能與維持炎性因子平衡、保護(hù)腸微生態(tài)豐富性與多樣性相關(guān)。往后需要更多的研究進(jìn)一步明確是否有特定的微生態(tài)菌屬在CD致病中起作用，以及從細(xì)胞層面深入研究要素飲食、免疫及微生態(tài)之間的密切聯(lián)系。