miR-374b 與Myf6 在綿羊不同生長時期骨骼肌中表達(dá)規(guī)律的研究

李 倩，李蘭蘭，欒兆進(jìn)，王國義，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.包頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古包頭 014013；3.赤峰市敖漢種羊場，內(nèi)蒙古赤峰 024300）

骨骼肌發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要包括骨骼肌細(xì)胞增殖、分化、肌管融合、肌纖維肥大等，這一系列過程會受到一些調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，除廣泛所知的生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFs）和肌細(xì)胞增強因子家族（MEF2）起調(diào)控作用外，已經(jīng)有越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)是另一種重要的調(diào)節(jié)因子。因此，研究調(diào)控綿羊肌肉生長發(fā)育的分子機制，進(jìn)而為肉羊分子育種提供一定的理論依據(jù)。

miRNA 的表達(dá)有著組織特異性，并且它們中的大多數(shù)僅在特定組織和發(fā)育階段表達(dá)并起作用[1]。一組稱為MyomiRs 的miRNAs 在心肌或骨骼肌中高度表達(dá)，主要包括miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208、miR-208b、miR-486 及miR-499[2-4]。近年來，在生物科學(xué)方面關(guān)于miRNAs 對動物生理調(diào)控的研究十分火熱。同樣也有大量的研究表明miRNAs 在肌肉發(fā)育方面有著強大的調(diào)控作用。Dicer（miRNAs 成熟所必需的酶）的缺失引起小鼠肌肉發(fā)育異常而死亡[5]。miR-140-3p 同樣對骨骼肌細(xì)胞具有調(diào)控作用[6]；miR-151-3p 通過調(diào)控ATP2a2 的表達(dá)量來影響骨骼肌細(xì)胞的形成[7]。多種miRNAs 通過與MRFs 的相互作用在成肌細(xì)胞的增殖和分化中起到至關(guān)重要的作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-374b 特異性結(jié)合Myf6的3' 非翻譯區(qū)（UTR），miR-374b 可直接靶向Myf6并負(fù)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞生成，在mRNA 和蛋白水平下調(diào)Myf6基因的表達(dá)[9]。

迄今對miR-374b 的研究多集中在對癌細(xì)胞和小鼠成肌細(xì)胞增殖分化的影響，但是否對綿羊等家畜骨骼肌生長發(fā)育有影響鮮有報道。因此，本實驗檢測綿羊不同發(fā)育生長階段miR-374b 和Myf6基因的表達(dá)規(guī)律及其與單根肌纖維橫截面積變化規(guī)律的關(guān)系，探究出miR-374b 是否會通過其靶標(biāo)基因Myf6影響綿羊的骨骼肌生長發(fā)育，進(jìn)而為肉羊分子育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實驗羊均來自內(nèi)蒙古赤峰敖漢種羊場，選取同一飼養(yǎng)管理條件下，健康的胎齡90 d、胎齡120 d、初生期、出生后60 d 南非肉用美利奴羊各4 只，采取背最長肌、股二頭肌組織樣品置于無RNA 酶的凍存管中，迅速投入液氮，帶回實驗室于-80℃冰箱凍存，用于總RNA 的提?。灰徊糠直匙铋L肌、股二頭肌保存于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色試驗。

1.2 主要試劑 iTaqUniwersal SYBR Green Supermix5 mL購自秀佰瑞生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、無水乙醇、二甲苯均購自天津化學(xué)試劑有限公司；石蠟購自上海華靈康復(fù)器械廠；伊紅購自國藥化學(xué)集團試劑有限公司；蘇木素購自上海新中化學(xué)廠。

1.3 組織總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法進(jìn)行總RNA 的提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，蛋白核酸分析儀進(jìn)行cDNA 濃度及其OD 值檢測。

1.4 實時熒光定量 熒光定量檢測在伯樂熒光定量PCR儀CFXConnect中進(jìn)行，Myf6與GAPDH反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 個循環(huán)；mir-374b 和5sRNA 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；PCR 反應(yīng)95℃12 s，62℃ 40 s，共40 個循環(huán)，62℃時采集熒光信息。

1.5 HE 染色 ①將已經(jīng)切好的切片放至染色架上；②染色：二甲苯(Ⅰ)，8 min →二甲苯(Ⅱ)，8 min →無水乙醇(Ⅰ)，5 min →無水乙醇(Ⅱ)，5 min →95%酒精(Ⅰ)，3 min →95% 酒精(Ⅱ)，3 min →80% 酒精，2 min →70% 酒精，2 min →50% 酒精，2 min →蒸餾水，2 min →蘇木精，8 min →自來水，2 min →蒸餾水，2 min →1%酒精鹽酸，3～5 s →自來水藍(lán)化，15 min →蒸餾水，2 min →50%酒精，2 min →70%酒精，2 min →80% 酒精，2 min →伊 紅，2 min →95% 酒精(Ⅰ)，3 min →95%酒精(Ⅱ)，5 min →無水乙醇(Ⅰ)，5 min →無水乙醇(Ⅱ)，5 min →二甲苯(Ⅰ)，5 min →二甲苯(Ⅱ)，5 min；③封片：于載玻片的標(biāo)本上滴加中性樹膠并用蓋玻片覆蓋，于陰涼通風(fēng)處晾干。

1.6 統(tǒng)計分析 使用SPASS 20.0 軟件對miR-374b 和Myf6基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt計算進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用SPASS 17.0 軟件將4 個不同生長時期Myf6、mir-374b 基因的mRNA表達(dá)量和單根肌纖維橫截面積變化進(jìn)行相關(guān)性Person檢驗。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 擴增 如圖1 所示，miR-374b、Myf6和內(nèi)參基因5sRNA、GAPDH的熔解曲線峰值圖只有一個特異性高峰，無其他雜峰，表明引物具有較高特異性，可用來進(jìn)行下一步實驗。

2.2 miR-374b、Myf6基因在不同時期背最長肌中的表達(dá)規(guī)律 由表1 可知，背最長肌中miR-374b 和Myf6基因的mRNA 表達(dá)量都在胎齡90 d 時最高，且極顯著高于其他3 個時期。miR-374b 在出生后60 d 表達(dá)量最低，miR-374b 在這4 個不同生長時期mRNA 相對表達(dá)量總體呈下降趨勢；Myf6在初生期表達(dá)量最低，由初生至出生后60 d 呈上升趨勢。

由表2 可知，miR-374b 的表達(dá)量在股二頭肌中胎齡120 d 時最高且極顯著高于其他3 個時期，出生后60 d 表達(dá)量最低；Myf6胎齡90 d 表達(dá)量最高且極顯著高于其他3 個時期，初生期表達(dá)量低。miR-374b 和Myf6基因在4 個時期股二頭肌中的表達(dá)量呈相反趨勢。

2.4 不同生長時期肌肉組織切片結(jié)果 背最長肌與肱二頭肌在不同生長時期的肌肉組織切片結(jié)果如圖2 所示。

2.5 不同時期單根肌纖維橫截面積 由圖3 可知，背最長肌和股二頭肌單根肌纖維橫截面積隨著月齡的增加均呈極顯著增長；股二頭肌單根肌纖維橫截面積總大于背最長肌。

2.6 miR-374b、Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積的相關(guān)性分析 由表3 可知，在背最長肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.941，P＜0.01），Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.625，P＜0.05）；在股二頭肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.677，P＜0.05）；Myf6表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化無顯著性相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

表1 miR-374b、Myf6 在不同時期背最長肌中mRNA 相對表達(dá)量

表2 miR-374b、Myf6 基因在不同時期股二頭肌中mRNA 相對表達(dá)量

表3 背最長肌中miR-374b、Myf6 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積相關(guān)性分析

在肌肉發(fā)育的全部過程中，從胚胎期肌祖細(xì)胞的遷移、增殖、分化及肌纖維的形成，到動物在出生后肌肉組織成熟及功能越來越完善，生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族都有參與[10]。Myf6 是僅有的一個存在于成熟神經(jīng)節(jié)中的MRFs 家族中的成員[11]，亦位于其他生肌bHLH 因子的下游，在肌纖維的形成和肌肉表型的維持中起作用。

miRNAs 是關(guān)于肌纖維以及骨骼肌生長發(fā)育的重要調(diào)控因子，已有miR-1、miR-133 和miR-206 等micro RNA 被證實參與調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖分化。有研究顯示，將含有miR-1、miR-133 和miR-206 質(zhì)粒的混合液注射到大鼠的脛骨前肌損傷的地方，會使得骨骼肌再生能力增強，受到損后的第3 天和第7 天MyoD1、MyoG和Pax7表達(dá)水平上升[12]，就會使得肌肉受到損傷后得到一定的修復(fù)。此外，對骨骼肌的再生有重要作用的還有一些其他的非肌源性microRNA。miR-431 會通過靶向Smad4使老化的骨骼肌再生[13]。但也有一些microRNA 會對骨骼肌生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，miR-128 能夠使得Sp1 的表達(dá)受到抑制，從而調(diào)控牛成肌細(xì)胞的增殖[14]；miR-128 可以靶向肌肉生長抑制素（MSTN），使骨骼肌細(xì)胞增殖受到抑制從而促進(jìn)其分化[15]。還有研究證明在小鼠中miR-374b 可直接靶定Myf6基因以調(diào)控成肌細(xì)胞的分化，而miR-374b在綿羊出生前及出生后的不同骨骼肌發(fā)育時期與Myf6基因的表達(dá)關(guān)系還未有研究。本研究結(jié)果表明，miR-374b 與Myf6基因在南非肉用美利奴羊的4 個不同發(fā)育生長階段的背最長肌中mRNA 表達(dá)變化趨勢基本一致，都呈下降趨勢，但是在出生后60 d 時miR-374b 基因mRNA 表達(dá)量持續(xù)下降，Myf6基因表達(dá)量呈上升趨勢；在股二頭肌中miR-374b mRNA 表達(dá)量先上升后下降，Myf6基因mRNA 表達(dá)量先下降后上升，2 個基因mRNA 表達(dá)變化趨勢相反，Myf6western blot 蛋白實驗結(jié)果與Myf6基因Q-PCR 實驗結(jié)果基本一致。隨著綿羊日齡的增加、體重體長增加、肌纖維增粗，miR-374b 的表達(dá)量總體呈下降趨勢。該結(jié)果說明miR-374b對Myf6基因的負(fù)調(diào)控作用在這4 個時期主要表現(xiàn)在股二頭肌中，推測miR-374b 在綿羊不同部位生長發(fā)育的前后期所發(fā)揮的生物學(xué)功能不同，miR-374b 對綿羊骨骼肌生長發(fā)育具有一定的負(fù)調(diào)控作用。

骨骼肌是動物體的核心成分，一些產(chǎn)肉量高的動物骨骼肌約占動物體的一半。骨骼肌主要是由肌纖維組成，各肌纖維類型所占的比例決定了動物的肉產(chǎn)量和肉質(zhì)風(fēng)味[16-17]。一般來說，肌肉纖維數(shù)量能夠在哺乳動物胎兒發(fā)育階段達(dá)到最大值，出生之后肌纖維的數(shù)量通常不會改變，肌肉的生長主要取決于肌纖維直徑的增長和肌纖維類型的相互轉(zhuǎn)化[18]。骨骼肌的生長和肥大與許多因素有關(guān)，包括動物飲食和外部環(huán)境。骨骼肌的發(fā)育是一個非常復(fù)雜的生物過程，受許多遺傳因素的調(diào)節(jié)，如肌源性調(diào)節(jié)因子、原代細(xì)胞生成素和肌肉生長抑制素[19]。本實驗結(jié)果表明，南非肉用美利奴羊的4 個不同發(fā)育生長階段的背最長肌和股二頭肌單根肌纖維橫截面積隨著月齡的增長而增大，肌纖維橫截面積均表現(xiàn)為股二頭肌＞背最長?。辉诒匙铋L肌及股二頭肌中miR-374b 表達(dá)量與單根肌纖維橫截面積變化分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)；而Myf6表達(dá)量在背最長肌中與單根肌纖維橫截面積變化顯著性負(fù)相關(guān)，在股二頭肌中與單根肌纖維橫截面積變化無顯著相關(guān)關(guān)系。馬志遠(yuǎn)[20]研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-374b 可使快肌纖維和慢肌纖維均受到抑制，由此推測miR-374b 負(fù)向調(diào)控肌纖維生長。

4 結(jié) 論

由本實驗結(jié)果推測，miR-374b 在4 個生長時期（胎齡90 d、胎齡120 d、初生期、出生后60 d）主要在股二頭肌對Myf6基因起負(fù)調(diào)控作用。利用miR-374b、Myf6在綿羊不同時期的表達(dá)規(guī)律及其與單根肌纖維橫截面積的關(guān)聯(lián)分析，得出miR-374b 可能是負(fù)向調(diào)控肌纖維生長。