櫻桃谷鴨PRKCA 基因多態(tài)性與蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)性分析

譚光輝，張依裕，李杰章，覃媛鈺，吳 磊

（貴州大學動物科學學院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025）

蛋殼品質(zhì)的提高一直是家禽生產(chǎn)中亟待解決的一個關鍵問題，高質(zhì)量蛋殼不僅能夠防止微生物的感染和機械破損，而且能夠提高孵化率并解決運輸中破損等問題。鈣作為蛋殼不可或缺的營養(yǎng)因素，占蛋殼重量的40% 左右，鈣沉積與蛋殼質(zhì)量的好壞有直接聯(lián)系?？梢?，鈣在蛋殼形成的過程中非常重要。探究與Ca2+調(diào)控相關基因的多態(tài)性，進而通過選擇培育來改善蛋殼品質(zhì)是一個有效的途徑。蛋白激酶Cα（Protein kinase C-alpha,PRKCA）是一類絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶，可被鈣和第二信使二?；视图せ?，屬于蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）家族成員之一，其家族成員磷酸化多種蛋白靶點，參與多種信號通路的調(diào)控機制，包括鈣離子信號通路調(diào)控[1-4]。近年來，眾多關于人PRKCA基因生物功能的研究表明，PRKCA基因控制細胞內(nèi)鈣離子濃度，與腫瘤增殖、侵襲、藥物抵抗性密切相關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。另外，蛋白激酶Cα在上皮組織中起著重要的作用，并且能夠通過對Ca2+進行調(diào)控促進細胞的存活與增殖[7-8]。相反，在三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）細胞中，Ca2+能夠介導PRKCA的活化來誘導細胞凋亡和抑制細胞的遷移[9-10]。因此，PRKCA基因與Ca2+能夠通過相互調(diào)節(jié)來調(diào)控細胞的增殖與凋亡。此外，PRKCA基因在動物機體中也發(fā)揮重要作用，Pan 等[11]研究顯示骨骼PRKCA基因表達增加可促進雞骨骼鈣素的沉積；Monteverde 等[12]研究發(fā)現(xiàn)利用小鼠胚胎成纖細胞（mef）致癌轉(zhuǎn)化時，Ca2+信號調(diào)節(jié)能促進PRKCA海拉細胞的激活。當小鼠PRKCA基因敲除后，心肌細胞收縮能力發(fā)生改變，進一步研究揭示PRKCA基因可能是心肌細胞收縮力和Ca2+處理的基本調(diào)控因子[13]。綜合前人研究可見，PRKCA基因在Ca2+的轉(zhuǎn)運調(diào)控中有重要作用，因此PRKCA基因可能調(diào)控鴨蛋殼腺部位Ca2+的釋放或調(diào)控相關組織細胞的增殖與凋亡，對蛋殼品質(zhì)產(chǎn)生影響，但迄今為止，有關PRKCA基因在鴨上的生物功能研究尚未見相關報道。基于此，本實驗以櫻桃谷鴨為研究素材，檢測PRKCA基因的遺傳變異，探討基因變異對鴨蛋殼品質(zhì)的影響，旨在為提高鴨蛋殼品質(zhì)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 于貴州大學動物科學學院家禽研究所隨機選擇同一天孵化、健康無病櫻桃谷鴨200 只，在相同的自由放養(yǎng)的環(huán)境長大，直到10 周齡時進行單體籠飼養(yǎng)，并且每只鴨靜脈采血1～1.5 mL 用于鴨基因組DNA的提取。在45 周齡時，每只母鴨連續(xù)7 d 收集鴨蛋以測定蛋殼質(zhì)量。鴨蛋重、蛋殼重、蛋殼強度和蛋殼厚度在收集雞蛋后12 h 內(nèi)測量。

1.2 蛋殼品質(zhì)的測量 蛋重和蛋殼重：洗凈鴨蛋上鴨糞等污染物后用電子天平（型號為BL-320H，購自日本島津公司）稱量；去除蛋黃和里面殘留蛋液稱量蛋殼重量。

蛋形指數(shù)：游標卡尺（購自武漢道簡貿(mào)易有限公司）測量鴨蛋的長徑和短徑，精確到0.1 mm，蛋形指數(shù)等于長徑/短徑。

蛋殼厚度：蛋殼厚度測定儀（型號ETG-1061，購自北京天翔飛域儀器設備有限公司）分別測定銳端、鈍端和側(cè)面的蛋殼厚度，取3 個值的平均數(shù)得到蛋殼厚度，精確度0.01 mm。

蛋殼強度：蛋殼強度是蛋殼致密堅固性指標，指對蛋碰撞和擠壓的承受能力。用蛋殼強度測定儀（型號為EFR-01，購自北京天翔飛域儀器設備有限公司）測定，單位為N/cm2。

1.3 血液基因DNA 的提取、引物設計 根據(jù)血液DNA提取試劑盒（購于天根生化科技有限公司）抽提血液中基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合核酸濃度測定儀進行檢測，并用Nanodrop 2000 檢測提取DNA 的純度和濃度，最終稀釋成濃度100 ng/μL 備用。在Genbank數(shù)據(jù)庫調(diào)取鴨PRKCA基因組外顯子序列（登錄號：NC_040064.1）運用在線版 Primer 3.0（http://primer3.ut.ee/）設計引物見表1，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR 擴增程序 反應體系：PCR Master Mix 10.0 μL，RNase-Free Water 7.5 μL，10 pmol/L 正、反向引物各1.0 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR 擴增程序：95℃預變性6 min；94℃變性30 s，退火（溫度見表1）50 s，72℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。以個體DNA為模板進行擴增，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測有目的條帶的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5 統(tǒng)計分析 測序結(jié)果采用DNA Star 軟件中MegAlign程序篩查鑒定SNP 位點，運用SHEsis 網(wǎng)上在線軟件（http://analysis.bio-x.cn/）計算SNP 位點的基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值（χ2）、連鎖不平衡的D'值和γ2值、觀察雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）；采用SPSS18.0 軟件中的一般線性模型（GLM）分析SNP 位點基因型或雙倍型與所測定性狀指標的相關性，結(jié)果用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1PRKCA基因PCR 擴增 如圖1 顯示，經(jīng)過PCR 擴增所獲得的目的片段呈現(xiàn)單一、明亮的條帶，且PCR擴增產(chǎn)物與預設片段大小相符，擴增產(chǎn)物可用于下一步的實驗研究。

表1 鴨PRKCA 基因的引物信息

2.2 櫻桃谷鴨PRKCA基因SNPs 篩查與鑒定 PCR 產(chǎn)物進行直接測序，利用DNAStar 軟件和MegAlign 程序分析測序結(jié)果，將PRKCA基因原始序列和全部櫻桃谷鴨引物擴增序列進行比對，查找單核苷酸多態(tài)位點，結(jié)果見圖2，共發(fā)現(xiàn)2 個SNP 變異位點：分別是g.9583222C＞T 和g.9583228G＞A，都位于PRKCA基因第7 外顯子，分別位于基因CDS 區(qū)第723 位和729 位，2 個突變位點均產(chǎn)生3 種基因型。

2.3 櫻桃谷鴨PRKCA基因2 個SNPs 的遺傳特性分析 對2 個SNP 進行遺傳特性分析，結(jié)果見表2，g.9583222C＞T 和g.9583228G＞A 2 個位點的優(yōu)勢基因型分別為CC 和GG，頻率分別為0.510 和0.385；優(yōu)勢等位基因分別是C 和G，頻率分別是0.675 和0.563；2 個SNP 位點均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），經(jīng)χ2檢驗2 個SNP 位點的等位基因都極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.01）。

2.4 SNPs 連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析 對櫻桃谷鴨檢測的2 個SNP 位點g.9583222 C＞T 和g.9583228 G＞A 進行連鎖不平衡分析，結(jié)果2 個SNP 位點之間的D'值等于1，大于0.800；γ2值等于0.385，大于0.330。根 據(jù)Ardlie 等[14]和Slatkin[15]的 報 道，當|D'|＞0.8 和γ2＞0.33 時認為SNPs 位點間存在強連鎖不平衡。揭示了本研究發(fā)現(xiàn)的2 個SNP 位點間存在強連鎖不平衡。

表2 櫻桃谷鴨PRKCA 基因SNP 位點群體遺傳參數(shù)

對2 個SNP 進行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果見表3。2 個SNP 位點在櫻桃谷鴨群體中共檢測到3 種單倍型和6 種雙倍型，單倍型H1 的頻率（0.513）最高，為優(yōu)勢單倍型；H3 的頻率（0.163）為劣勢單倍型；雙倍型H1H1 頻率（0.335）最高，為優(yōu)勢雙倍型，H3H3 的頻率（0.050）最低，為劣勢雙倍型。

表3 櫻桃谷鴨PRKCA 基因2 個SNP 位點的單倍型和雙倍型分析

2.5 櫻桃谷鴨PRKCA基因2 個SNPs 與蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)性分析 如表4 所示，g.9583222 C＞T 突變位點與蛋殼強度有顯著相關性，CT 基因型個體蛋殼強度顯著高于TT 型，其他基因型無顯著差異；g.9583228G＞A 位點對櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標的影響未能達到顯著水平。

2.6 SNPs 雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)指標的關聯(lián)性分析如表5 所示，雙倍型H1H3 和H2H2 個體蛋重顯著高于H3H3；H2H3、H3H3 雙倍型個體蛋殼厚度顯著高于H2H2；H3H3 蛋殼強度顯著高于H2H2。其他雙倍型與蛋殼品質(zhì)沒有產(chǎn)生顯著差異。

3 討 論

蛋殼質(zhì)量是影響禽蛋生產(chǎn)效益的重要因素之一，尤其在大型養(yǎng)殖場，蛋殼品質(zhì)極為重要。標記輔助選育是一種有效而簡便的可行辦法，找到性狀基因座相關聯(lián)的分子遺傳標記，則是實現(xiàn)分子標記輔助選擇的重要途徑。Haug 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRKCA基因需要甘油二酯（DAG）和磷脂酰絲氨酸（PS）和Ca2+輔因子的激活。PRKCA還能通過促進白三烯D4 升高細胞內(nèi)Ca2+濃度從而激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[17]。另外，PRKCA 激活劑在不同Ca2+下增加了滲透性動脈的收縮程度，而動脈收縮需要通過依賴性Ca2+流入，證明PRKCA誘導大鼠動脈收縮與Ca2+的降低有關[18]。目前，關于PRKCA基因遺傳變異對于鴨生產(chǎn)性能的效應研究未見報道。本實驗對櫻桃谷鴨PRKCA基因外顯子1、外顯子4 和外顯子7 進行SNP 位點檢測中，發(fā)現(xiàn)2 個同義突變位點，2 個SNP 位點的基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡。Hardy-Weinberg 平衡定律是一個基本的群體遺傳學原理，該定律建立在許多假設的基礎上，包括隨機交配的有性繁殖、世代不重疊、可忽略的突變和遷移率、兩性等位基因頻率的平等、缺乏自然選擇，同時，在任何有限的群體中，基因在配子中的隨機分離和在合子里的隨機重組都會導致一定的誤差，引起基因頻率的變化[19]。因此，從本研究結(jié)果來看，2 個SNP 基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡，可能受到突變、選擇、遺傳漂變等影響，或者與本實驗櫻桃谷鴨群體數(shù)量較少有關。

表4 櫻桃谷鴨PRKCA 基因SNP 位點與蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)性分析

表5 PRKCA 基因2 個SNPs 位點雙倍型與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)關聯(lián)性分析

動物體基因組功能結(jié)構(gòu)基因突變對其生產(chǎn)性能具有影響作用，其突變位點的連鎖關系決定群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化。本實驗通過對2 個SNP 進行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)SNP 間不存在強連鎖不平衡，發(fā)現(xiàn)3 種單倍型和6種雙倍型。理論上應該有4 種單倍型、9 種雙倍型，實際觀測值與理論值之間存在差異，可能是由于人工的長期選育導致單倍型（CG）和雙倍型TTGA、TTGG 和CTGG 個體被淘汰或者根本不存在該單倍型組合。本研究中，g.9583222C＞T 位點CT 基因型蛋殼強度顯著高于TT 基因型，該突變位點可以作為篩選較高蛋殼強度的分子標記。這種突變可能與PRKCA基因的功能等位基因有關，影響鴨子宮內(nèi)Ca2+的沉積。2 個SNP 位點構(gòu)建的雙倍型對蛋重、蛋殼強度和蛋殼厚度有顯著影響。雙倍型H3H3 有利于提高蛋殼強度和蛋殼厚度。蛋殼強度是蛋殼破損率最直接的體現(xiàn)，高強度蛋殼有利于降低蛋的破損，帶來可觀的經(jīng)濟效益，因此H3H3 是提高蛋殼品質(zhì)有利的雙倍型。可見2 個SNP 組合基因型對蛋殼品質(zhì)的影響效應明顯大于單個SNP 的影響。前人研究表明，同義突變雖然不會造成對應氨基酸的改變，但可能會反復改變調(diào)控剪接的外顯子基序，如果這些突變位點與剪接位點相鄰可能導致剪接位點失活[20]，而且單核苷酸的替換會改變mRNA 的剪切效率或準確性，對蛋白質(zhì)的功能、構(gòu)象和表達水平產(chǎn)生影響，進而調(diào)控機體鈣離子釋放，影響鈣蛋殼的形成過程[21-23]。由此推測，本研究檢測到的2 個SNP 共同聯(lián)合引起基因結(jié)構(gòu)變化強于單個SNP 對基因結(jié)構(gòu)變化的影響，其對蛋殼品質(zhì)的調(diào)控作用可能更有效。但在雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)分析中，雙倍型H3H3 個體數(shù)還是相對較少，因此，統(tǒng)計分析結(jié)果還需要進一步增加測試樣本，進一步確定本研究的結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，鴨PRKCA基因在所研究群體中存在一定的遺傳多樣性，在其外顯子7 發(fā)現(xiàn)2 個突變位點g.9583228 G ＞ A 和g.9583222 C ＞ T。關聯(lián)性分析表明，單個SNP 位點（g.9583222C＞T）與櫻桃谷鴨蛋殼品質(zhì)有顯著相關性，其中CT 基因型能顯著提高蛋殼強度。2 個SNP 位點組合基因型與蛋殼品質(zhì)有顯著相關性，組合基因型CCAA 認為是提高蛋殼品質(zhì)有利的組合基因型。