不同載體蛋白制備的3 型肺炎球菌結(jié)合物在小鼠體內(nèi)免疫原性比較

楊英英 張鈺奇 任珍蕓 張麗芝 馬凱凱 高晶晶 杜嬌 王欣茹 喬瑞潔 馬鈺 周海飛 王璽 羅樹權(quán)

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州730046

肺炎鏈球菌是肺炎的主要病原體，可引發(fā)腦膜炎、菌血癥、敗血癥等侵襲性感染疾病及中耳炎、社區(qū)獲得性肺炎等常見的疾病。據(jù)統(tǒng)計，全球已有120 萬兒童死于肺炎球菌引起的肺炎和腦膜炎［1］。在發(fā)達國家，肺炎球菌引起的肺炎死亡率為11%～40%［2］。在引起肺炎球菌發(fā)病的諸多血清型中，3 型肺炎球菌是引起兒科復(fù)雜肺炎球菌性肺炎和中耳炎的主要病原體，同時也是引起兒童和成人侵襲性肺炎最常見的病原體［3，4］。

莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要毒力因子和保護性抗原，其屬于T 細(xì)胞非依賴性抗原，不能保護兩歲以下嬰幼兒肺炎球菌引起的感染，只有與載體蛋白結(jié)合后成為T 細(xì)胞依賴性抗原才能對嬰幼兒產(chǎn)生免疫保護。

GSK 公司最初研制的11 價肺炎結(jié)合疫苗中包含3 型肺炎球菌，使用流感嗜血桿菌蛋白D（PD）為載體，但最終因為3 型肺炎球菌的保護效果差而放棄加入3型肺炎球菌，以10 價肺炎結(jié)合疫苗上市［5］。2010 年輝瑞公司上市的PCV13 中包含血清型3 型肺炎球菌，使用的載體為CRM197。PCV13 上市后，兒童侵襲性肺炎和中耳炎的發(fā)病率顯著降低［6］，并產(chǎn)生了疫苗血清型群體免疫保護作用［7］，但來自7 個國家的研究數(shù)據(jù)顯示，PCV13 對3 型肺炎球菌的免疫保護效果差［8-16］。

多糖蛋白結(jié)合疫苗的免疫原性受多糖結(jié)構(gòu)完整性、多糖糖鏈長度、游離多糖含量、載體蛋白性質(zhì)、結(jié)合物分子大小、多糖與蛋白比值及佐劑的免疫增強效應(yīng)等多種因素影響，而載體蛋白的性質(zhì)是免疫原性影響因素中最重要的一個［17］。由于3 型肺炎球菌、PD 及CRM197 制備的結(jié)合物的免疫保護效果欠佳，本文選擇了2 種載體蛋白（TT 和rEPA），并將這兩種蛋白分別進行己二酸二酰肼（adipic acid dihydrazide，ADH）衍生，制備出兩種衍生蛋白（TTAH和rEPAAH），用相同的結(jié)合方法將3 型莢膜多糖與這4 種載體蛋白制備了4種結(jié)合物，比較不同載體蛋白制備的3 型肺炎球菌結(jié)合物在小鼠體內(nèi)的免疫原性，評價不同載體蛋白制備的3 型肺炎球菌結(jié)合物在小鼠體內(nèi)免疫原性的差異。

1 材料與方法

1.1 樣品 3 型肺炎球菌莢膜多糖（PS3）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、破傷風(fēng)類毒素衍生物（TTAH）、重組銅綠假單胞菌外毒素A（rEPA）、重組銅綠假單胞菌外毒素A 衍生物（rEPAAH）均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司制備。

1.2 實驗動物 實驗動物為美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）雌性小鼠［編號：SYXK（甘·2017-0001）］150 只，SPF 級，體重約12～14g，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司動物室提供。

1.3 主要試劑 ADH、1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽（CDAP）、三乙胺（TEA）、乙腈、脫氧膽酸鈉（DOC）和蒽酮均購自Sigma 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗-鼠、羊抗-兔IgG 均購自美國Southernbiotech 公司；精制破傷風(fēng)抗毒素血清、精制重組銅綠假單胞菌外毒素血清及3 型肺炎球菌超免血清均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司制備；HCl、乙酸、NaOH 和NaCl均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 Labscale 超濾系統(tǒng)和超濾膜均購自Millipore 公司；Spectra MAX190 酶標(biāo)儀購自Costar 公司；96 孔酶標(biāo)板（Costar 92592）購自美國Corning 公司；AKTA prime plus 型層析系統(tǒng)、Sepharose CL-4B 凝膠、Sepharose 4 fast flow 凝膠及XK16/100 層析柱均購自GE 公司；高壓液相色譜儀、2707 型自動進樣器和2489型紫外檢測器均購自Waters 公司；高效液相排阻層析柱（TSK-4000 PWXL、TSK-6000 PWXL及TSK-3000 SWXL）購自TOSOH 公司；十八角激光光散射儀（Wyatt DAWN HELEOS-Ⅱ）和示差監(jiān)測器（Wyatt Optilab T-rEX）均購自美國Wyatt 公司。

1.5 多糖水解物的制備 PS3 反應(yīng)終濃度為5mg/mL，醋酸終濃度為0.5M，80℃反應(yīng)15h、次日冷卻至室溫，用5M NaOH 調(diào)節(jié)水解物溶液pH 至7.0 左右終止反應(yīng)。水解物溶液用注射用水超濾4 次后凍干。水解物經(jīng)Sepharose CL-4B 上樣，測定其分子大小分布。用高效液相-排阻層析-十八角激光光散射儀（HPSECMALLS）聯(lián)用法測定水解物分子量［18］。并通過1H NMR確認(rèn)水解物結(jié)構(gòu)的正確性。

1.6 TT 及rEPA 衍生物的制備 采用EDAC 縮合法，將TT 及rEPA 分別用0.85%NaCl 溶液稀釋至終濃度為10mg/mL，然后將其加入等體積的0.9mol/L ADH 中，調(diào)節(jié)至pH6.5，加入EDAC 使其終濃度為7.5mmol/L，控制pH 在（6.5±0.1），反應(yīng)2h，調(diào)節(jié)至pH8.0，終止反應(yīng)，用含0.85%NaCl 將衍生物超濾濃縮，除菌過濾得到的衍生物為TTAH及rEPAAH。以Lowry 法測定兩種衍生物的蛋白含量，TNBS 法測定衍生率。

1.7 結(jié)合物的制備及純化 PS3 水解物用0.85%NaCl 溶解成5mg/mL，室溫靜置過夜，測初始pH 值并將其調(diào)至5.8～6.0。將CDAP 以200mg/mL 濃度溶于乙腈中，加入多糖降解物一半質(zhì)量的CDAP，維持pH5.8～6.0 反應(yīng)30s。用TEA 溶液（28μL TEA+972μL WFI）將pH 維持在（7.3±0.5）反應(yīng)2min。按投入糖：蛋白質(zhì)量比為1∶1 分別加入TT、TTAH、rEPA 及rEPAAH，維持pH（8.0±0.2）反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后將pH 值調(diào)至7.0，將反應(yīng)物裝入截留分子量為10kDa 的透析袋中，以0.85%NaCl 溶液為透析外液，透析2天，收集結(jié)合物。制備的四種結(jié)合物分別為PS3-TT、PS3-TTAH、PS3-rEPA 及PS3-rEPAAH。

四種結(jié)合物均經(jīng)Sepharose 4fast flow 層析柱純化，收集KD≤0.2 的洗脫液，流動相為0.85%NaCl 溶液。將收集的洗脫液以0.22μm 膜除菌過濾后于2℃～8℃保存。

1.8 鑒別試驗 運用瓊脂糖免疫雙擴散法分別對四種結(jié)合物進行鑒別試驗，方法參照《中華人民共和國藥典》2015 版（四部）的通則3403 要求執(zhí)行［18］。

1.9 結(jié)合物的理化檢測 分別測定上述四種3 型肺炎球菌結(jié)合物的多糖含量、蛋白質(zhì)含量、游離多糖、游離蛋白含量及重均分子量。多糖含量檢測參照采用蒽酮硫酸法；蛋白質(zhì)含量檢測采用Lowry 法；游離多糖含量檢測采用脫氧膽酸鈉法［18］；游離蛋白質(zhì)含量檢測采用高效液相色譜法［18］。采用高效液相-排阻層析-十八角激光光散射儀（HPSEC-MALLS）聯(lián)用法測定結(jié)合物分子量［18］。

1.10 結(jié)合物免疫原性研究

1.10.1 動物免疫。將小鼠隨機分為多糖對照組、免疫PS3-TT、PS3-TTAH、PS3-rEPA、PS3-rEPAAH四種結(jié)合物，每組30 只。多糖對照組是將3 型多糖水解物用生理鹽水稀釋為4.0μg/mL。四種結(jié)合物根據(jù)其對應(yīng)的多糖含量分別用生理鹽水其稀釋至多糖終濃度為4.0μg/mL。免疫程序為0、14、28 天分別進行第1、2、3針腹股溝皮下注射，劑量為每針次每只小鼠免疫0.1mL，即每針次每只小鼠0.4μg。

1.10.2 ELISA。每針免疫后間隔14 天進行小鼠眼球采血，分離血清，用間接ELISA 測定血清抗PS3 IgG 含量［18］。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Softmax 軟件分析中提供的四參數(shù)擬合法分析數(shù)據(jù)，陽性血清ELISA 單位為800EU/mL，應(yīng)用分析模板計算各樣品的ELISA 單位，根據(jù)血清數(shù)量計算幾何平均值得到ELISA 單位的幾何平均值（GMU）。采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，免疫原性的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水解物的分子大小 3 型多糖經(jīng)乙酸水解后呈對稱性分布，頂峰KD值為0.5。見圖1。HPLC-SECMALLS 測定其重均分子量為6.45×104g/mol，分子量分布范圍為1.74×104～44.75×104g/mol。

2.2 水解物的NMR 分析 多糖經(jīng)水解后，水解物的結(jié)構(gòu)與水解前相比結(jié)構(gòu)完全相同，說明多糖水解過程中并未改變多糖的結(jié)構(gòu)。見圖2。

2.3 TT 及rEPA 衍生物的化學(xué)檢定結(jié)果 從衍生率結(jié)果看，兩種蛋白上均成功地與ADH 連接。見表1。

2.4 鑒別試驗 四種3 型結(jié)合物均能同時與3 型多糖免疫血清和TT/rEPA 免疫血清產(chǎn)生沉淀線，且兩條沉淀線發(fā)生融合，陰性對照生理鹽水與3 型多糖免疫血清和TT/rEPA 免疫血清均不產(chǎn)生沉淀線，說明四種結(jié)合物均具有良好的抗原性。見圖3。

2.5 3型肺炎球菌結(jié)合物理化及分子量檢測 四種結(jié)合物中游離多糖含量較低，均在3%以內(nèi)；游離蛋白質(zhì)含量也較低，在5%以內(nèi)。四種結(jié)合物的糖蛋白比在0.60～1.00。PS3-TTAH與PS3-rEPAAH重均分子量結(jié)果相近，均在3.60×106左右，PS3-TT 與PS3-rEPA 重均分子量結(jié)果相近，均在2.00×106～2.60×106。見表2。

2.6 IgG 抗體含量檢測 隨著免疫針次的增加，PS3對照組3 針免疫IgG 含量無明顯差異，但結(jié)合物組IgG含量明顯升高。4 種結(jié)合物在小鼠體內(nèi)均能產(chǎn)生較高水平的抗體。蛋白衍生后的結(jié)合物組（PS3-TTAH及PS3-rEPAAH）第2、3 針I(yè)gG 含量均明顯低于其對應(yīng)的蛋白未衍生組（PS3-TT 及PS3-rEPA）。見表3。

圖1 3 型肺炎球菌多糖水解物的Sepharose CL-4B 分布圖

圖2 3 型肺炎球菌多糖水解物1H NMR 圖譜

表1 蛋白質(zhì)衍生物檢測結(jié)果

隨著免疫針次的增加，PS3 組3 針免疫無劑次加強效應(yīng)，4 組結(jié)合物第2、3 針之間均有明顯的劑次加強效應(yīng)。對于同類載體蛋白，PS3-TTAH比PS3-TT 第3針抗體的水平低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.31）；PS3-rEPAAH比PS3-rEPA 第3 針抗體的水平低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.21）。對于不同類均未衍生載體蛋白，PS3-TT 比PS3-rEPA 第3 針抗體的水平高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.17）；對于不同類均經(jīng)衍生的載體蛋白，PS3-TTAH比PS3-rEPAAH第3 針抗體的水平高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.28）；PS3-TTAH與PS3-rEPA 第3 針抗體水平相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.99）。見圖4。

圖3 四種3 型肺炎球菌結(jié)合物免疫雙擴散檢測結(jié)果

表2 結(jié)合物理化及分子量檢測結(jié)果

表3 3 型肺炎球菌結(jié)合物免疫小鼠后血清中特異IgG 抗體含量（EU/mL）

圖4 3 型肺炎球菌結(jié)合物免疫小鼠后血清中特異IgG 抗體含量柱狀圖

3 討論

目前，用于上市疫苗的載體蛋白有五種：DT、TT、CRM197、PD 及B 群腦膜炎球菌外膜蛋白（OMPC）。其中，用于肺炎結(jié)合疫苗的載體主要是DT、TT、CRM197和PD，其中輝瑞公司Prevenar13 使用的是CRM197作為載體，GSK 公司的10 價肺炎結(jié)合疫苗使用了三種載體TT、DT 及PD，其中18C 型結(jié)合物以DT 為載體，19F 型結(jié)合物以TT 為載體，其余8 個型結(jié)合物以PD為載體。

本試驗嘗試用肺炎結(jié)合疫苗中未使用過的一種新的載體-重組銅綠假單孢菌外毒素A（rEPA）制備2 種3 型肺炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物。比較其與TT 為載體制備的2 種3 型肺炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物在小鼠體內(nèi)的免疫原性差異。從四種結(jié)合物小鼠免疫原性結(jié)果來看，4 種均能產(chǎn)生較高的抗體滴度，其中PS3-TT 產(chǎn)生的抗體滴度最高，PS3-TTAH及PS3-rEPA 產(chǎn)生的抗體滴度相當(dāng)，PS3-rEPAAH產(chǎn)生的抗體滴度最低，但4 組結(jié)合物之間抗體濃度的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，蛋白TT 和rEPA 經(jīng)衍生后再結(jié)合，結(jié)合物的免疫原性有所降低。

蛋白質(zhì)衍生是通過EDAC 將蛋白質(zhì)的羧基端與ADH 連接從而增加蛋白質(zhì)表面的氨基或肼基的數(shù)量，進而增加蛋白與多糖結(jié)合時的結(jié)合率。本試驗顯示，衍生后的蛋白質(zhì)制備的結(jié)合物的免疫原性比未衍生的蛋白質(zhì)制備的結(jié)合物的免疫原性低，可能是衍生后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而影響了結(jié)合物的免疫原性。從結(jié)合物的重均分子量來看，衍生后的蛋白（TTAH及rEPAAH）與3 型多糖制備的結(jié)合物的分子量均比衍生前的蛋白（TT 及rEPA）高。說明蛋白經(jīng)過衍生后增加了與多糖結(jié)合的效率，使多糖與蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度提高。但同時也說明并非結(jié)合物的分子量與結(jié)合物的免疫原性一定呈正相關(guān)。

肺炎球菌莢膜多糖有諸多血清型，每個血清型最適合的載體蛋白可能并不相同，本試驗只針對3 型多糖，對于其他血清型最適宜的載體還需進一步研究。對于3 型肺炎球菌多糖，TT、TTAH、rEPA 及rEPAAH均是較好的載體。同時rEPA 可以作為一種新的候選載體運用于肺炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗。3 型肺炎球菌多糖與其他蛋白如CRM197、DT、PD 免疫原性的比較今后還需進一步探討。