肺癌靶向多肽熒光分子探針的研制及其應(yīng)用

李貴平，符珍敏，江英，齊永帥，池曉華，何云

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510515

前言

惡性腫瘤是當(dāng)前人類面臨的主要健康問題，肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺癌療效得不到有效提高的主要障礙是因?yàn)榉伟┰\斷時(shí)已是晚期，雖然目前肺癌的檢查方法多樣，但是很大部分患者可能是因?yàn)轶w質(zhì)量減輕、骨痛、頭痛或者是腫瘤癥候群才到醫(yī)院檢查，可能已經(jīng)出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］。基于小分子多肽的腫瘤分子影像學(xué)是目前臨床腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)［2］。小分子多肽cNGQGEQc 最早是由郭琳瑯等學(xué)者利用組合化學(xué)肽庫技術(shù)篩選出來的一種能夠與非小細(xì)胞肺癌結(jié)合的多肽，由8個(gè)氨基酸殘基組成的短肽，分子兩端的D 型半胱氨酸形成一對(duì)二硫鍵，是一個(gè)環(huán)形的多肽分子，研究發(fā)現(xiàn)cNGQGEQc（兩端半胱氨酸形成一對(duì)二硫鍵）可以通過細(xì)胞膜上的整合素α3 與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞結(jié)合［3］。本課題組前期已成功將放射性核素131I、99mTc 標(biāo)記多肽分子cNGQGEQc，并進(jìn)行SPECT 顯像［4-7］。這種多肽分子在合成過程中成本較高，耗時(shí)，本課題組在前期研究中還發(fā)現(xiàn)鏈狀多肽分子cNGQGEQc（兩端半胱氨酸不形成一對(duì)二硫鍵，簡(jiǎn)寫成cNGQGEQc-L）也可與肺腺癌A549 細(xì)胞株結(jié)合，鏈肽分子相對(duì)環(huán)肽合成更方便、更經(jīng)濟(jì)。本實(shí)驗(yàn)選擇能與整合素α3 受體結(jié)合的鏈狀多肽分子cNGQGEQc-L 作為靶向載體，將羧基熒光素（FAM）與cNGQGEQc-L連接構(gòu)建熒光分子探針，通過熒光成像探討該多肽分子探針用于肺腺癌顯像的可行性，為該探針的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用肺腺癌A549 細(xì)胞株，購買自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫。5～6 周齡、體質(zhì)量18～22 g的BALB/c nu/nu 裸鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。肺腺癌特異性靶向小分子多肽的氨基酸序列為cNGQGEQc，小分子鏈肽cNGQGEQc-L 及修飾有熒光素FAM 的小分子鏈肽（FAM-cNGQGEQc-L）由強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。

1.2 肺腺癌A549細(xì)胞與熒光多肽的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

利用熒光倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞與熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L的結(jié)合，方法如下：取對(duì)數(shù)期生長的肺腺癌A549細(xì)胞鋪入96孔板中孵育，每孔細(xì)胞數(shù)約104個(gè)，在細(xì)胞孵箱中孵育24 h后，分別加入濃度為0.3、0.7和1.0M的熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L，錫紙包裹后，在孵箱孵育1、3 h后吸去熒光多肽，PBS浸洗4遍，再加入多聚甲醛100μL固定10 min。吸去多聚甲醛，PBS浸洗3遍，每孔加入100μL DAPI溶液染核10 min，吸去DAPI，PBS浸洗3遍后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L與肺腺癌A549細(xì)胞的結(jié)合情況。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 肺腺癌A549 細(xì)胞與不同濃度熒光多肽結(jié)合曲線的測(cè)定

取對(duì)數(shù)期生長的肺腺癌A549細(xì)胞于EP管內(nèi)（細(xì)胞數(shù)約為4.5×105個(gè)），共9 管，倍比稀釋法加入不同濃度的熒光多肽，分別為0（空白對(duì)照組）、0.003 906 25、0.007 812 5、0.015 625、0.03125、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mmol/L，在搖床上避光孵育1 h，離心棄上清液，利用PBS 潤洗3 次，將1～9 號(hào)EP 管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1～9號(hào)流式管后，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定每管的熒光強(qiáng)度，分析并繪制熒光多肽的濃度與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度的攝取曲線。

1.4 肺腺癌A549 細(xì)胞與熒光多肽結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)

利用流式細(xì)胞儀測(cè)定肺腺癌A549細(xì)胞與熒光多肽的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，設(shè)置競(jìng)爭(zhēng)抑制組和實(shí)驗(yàn)組。方法如下：競(jìng)爭(zhēng)抑制組預(yù)先將肺腺癌A549 細(xì)胞與未修飾FAM的鏈肽cNGQGEQc-L（濃度為100μg/100μL）孵育30 min，然后吸去多肽，再加入熒光多肽FAMcNGQGEQc-L（濃度為25 μg/100 μL），孵育1 h。實(shí)驗(yàn)組則不添加未修飾FAM 的鏈肽，僅將細(xì)胞懸液至于同樣條件下孵育30 min，然后再加入等量的熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L（濃度為25 μg/100 μL），孵育1 h。最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定上述兩組A549 細(xì)胞上結(jié)合熒光多肽的熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行對(duì)比。

1.5 熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L在荷瘤裸鼠動(dòng)物模型中的熒光顯像研究

1.5.1 荷瘤裸鼠模型建立及腫瘤病理切片制作取3～4周齡的無胸腺裸鼠，右側(cè)腋窩用酒精棉球消毒2遍，將肺腺癌A549 細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為5～6×106個(gè)/150 μL）注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下。裸鼠在SPF 條件下飼養(yǎng)，定期觀察裸鼠成瘤情況并記錄。待腫瘤長至1 cm 左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取腫瘤組織制成組織切片，并進(jìn)行HE 染色，在正置顯微鏡下觀察腫瘤組織切片是否符合肺癌改變。

1.5.2 熒光多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)各器官生物分布及移植腫瘤的熒光顯像實(shí)驗(yàn)取上述建模成功的肺腺癌A549細(xì)胞移植荷瘤裸鼠，于實(shí)驗(yàn)前一晚禁食禁水，經(jīng)尾靜脈注射熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L（0.1 mg/150 μL）。將注射熒光多肽后的裸鼠置于暗室中，分別于1、2和5 h處死裸鼠，在器官分離過程中，盡量避免組織間熒光染料的交叉污染。提取的荷瘤裸鼠臟器有：腫瘤、肝臟、膽囊、脾臟、雙腎、胃腸、心臟、肺以及腦組織。將離體器官在100 mm 規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)皿上擺開，最后置于活體成像儀下進(jìn)行成像。在Bruker MI SE 軟件下觀察不同離體器官的熒光結(jié)合強(qiáng)度，分析腫瘤及各個(gè)臟器組織的熒光攝取值，計(jì)算腫瘤/非腫瘤比值（T/NT比值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L質(zhì)量控制分析報(bào)告

熒光探針FAM-cNGQGEQc-L 的質(zhì)譜分析報(bào)告顯示所制備的目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為1 195.31，與熒光探針的理論分子量1 196.20相近，化學(xué)純度在98%以上，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求（圖1）。

圖1 FAM-cNGQGEQc-L 的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of FAM-cNGQGEQc-L

2.2 肺腺癌A549 細(xì)胞與熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

倒置顯微鏡下熒光素FAM 發(fā)出黃綠色光，DAPI發(fā)出藍(lán)色光。熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 與肺腺癌A549細(xì)胞孵育1、3 h后，倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)均可見綠色熒光（圖2、圖3），提示熒光多肽可以與A549細(xì)胞膜結(jié)合并且可進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。相同濃度下，隨著孵育時(shí)間延長，孵育3 h時(shí)細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于1 h的熒光強(qiáng)度。

2.3 肺腺癌A549 細(xì)胞與不同濃度熒光多肽FAMcNGQGEQc-L結(jié)合曲線的測(cè)定結(jié)果

熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 與A549 細(xì)胞孵育1 h 后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，觀察不同濃度下A549細(xì)胞的熒光結(jié)合強(qiáng)度?？瞻讓?duì)照組中未見有熒光攝取，而實(shí)驗(yàn)組則可見熒光結(jié)合峰，如圖4所示。隨著熒光多肽濃度的增加，A549 細(xì)胞相對(duì)熒光結(jié)合強(qiáng)度逐漸增加。當(dāng)熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 的濃度大于0.125 mmol/L 時(shí)，A549 細(xì)胞的相對(duì)熒光結(jié)合強(qiáng)度趨近飽和。當(dāng)FAM-cNGQGEQc-L 熒光多肽濃度為0.125 mmol/L 時(shí)，結(jié)合熒光多肽的A549 細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值（P2/P1）為98.3%（圖5）。

圖2 倒置熒光顯微鏡下A549細(xì)胞與熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L（1 mol/L,70μL）孵育1 h的熒光攝取圖Fig.2 Inverted fluorescence microscope images showed the uptake of fluorescence-labeled polypeptide in A549 cells which were incubated with FAM-cNGQGEQc-L(1 mmol/L,70μL)for 1 hour

圖3 倒置熒光顯微鏡下A549細(xì)胞與熒光探針FAM-cNGQGEQc-L（1 mol/L,70μL）孵育3 h的熒光攝取圖Fig.3 Inverted fluorescence microscope image showed the uptake of fluorescence-labeled polypeptide in A549 cells which were incubated with FAM-cNGQGEQc-L(1 mmol/L,70μL)for 3 hours

2.4 肺腺癌A549 細(xì)胞與熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)

肺腺癌A549細(xì)胞與熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組肺腺癌A549細(xì)胞在加入濃度為0.025 mg/100μL的熒光多肽后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分A549 細(xì)胞均結(jié)合了熒光多肽；而在競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)組中可見，在預(yù)先加入4 倍劑量的cNGQGEQc-L（濃度為0.1 mg/100 μL）抑制后，A549 細(xì)胞幾乎與熒光多肽無結(jié)合。結(jié)果提示cNGQGEQc-L 能夠競(jìng)爭(zhēng)抑制熒光多肽與A549細(xì)胞的結(jié)合。

2.5 熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L在荷瘤裸鼠動(dòng)物模型中的熒光顯像研究

肺腺癌A549 細(xì)胞在裸鼠中建模成瘤時(shí)間約為6周，移植瘤腫瘤組織病理切片符合肺腺癌改變（圖7）。荷瘤裸鼠注射熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 后，分別于1、2、5 h 處死裸鼠，分離主要臟器組織，進(jìn)行活體離體臟器組織的熒光成像。顯像結(jié)果顯示上述3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤的熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于大腦、肺、心、肝、脾（P＜0.05）。腎臟可見到較強(qiáng)的熒光顯示，膽囊及胃腸也可見明顯熒光染料聚集，提示熒光探針可通過泌尿系統(tǒng)及膽道系統(tǒng)排泄。比較不同時(shí)間腫瘤與大腦、肺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟熒光平均攝取值的腫瘤/非腫瘤比值（T/NT比值），發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間的延長腫瘤/肺、腫瘤/心、腫瘤/肝、腫瘤/脾的T/NT 比值呈逐漸上升的趨勢(shì)。各臟器熒光攝取情況如圖8所示。荷瘤裸鼠于注射后1、2 和5 h 各主要器官的T/NT 比值見表1，結(jié)果顯示腫瘤攝取多肽要高于正常肝、脾、肺、心。

圖4 肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 的攝取Fig.4 Uptake of fluorescence-labeled polypeptide FAM-cNGQGEQc-L in lung adenocarcinoma A549 cells

3 討論

圖5 肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)不同濃度熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L的攝取曲線Fig.5 Uptake curve of different concentrations of fluorescence-labeled polypeptide FAM-cNGQGEQc-L in lung adenocarcinoma A549 cells

盡管目前醫(yī)療技術(shù)取得很大的進(jìn)展，癌癥仍舊是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的一個(gè)主要原因，如果能找到合適的適用于腫瘤顯像或治療的靶點(diǎn)，無論是腫瘤診斷還是治療都具有非常大的臨床價(jià)值。分子影像是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，機(jī)體內(nèi)存在某些細(xì)胞膜表面抗體、蛋白表達(dá)產(chǎn)物或蛋白酶等物質(zhì)，這類物質(zhì)可能在病理發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)或表達(dá)上調(diào)，可作為診斷疾病的標(biāo)志物，作為疾病診斷、治療的靶點(diǎn)，能夠在細(xì)胞水平及亞細(xì)胞層面提早發(fā)現(xiàn)病變，研制靶向分子探針是分子影像不可或缺的一部分［2,8-9］。

圖6 肺腺癌A549細(xì)胞與FAM-cNGQGEQc-L 熒光結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)Fig.6 Competitive inhibition experiment of lung adenocarcinoma A549 cells combining with fluorescence-labeled polypeptide

圖7 腫瘤HE染色病理切片圖Fig.7 Tumor pathological slice with HE staining

整合素是一種跨膜蛋白，一種細(xì)胞表面受體，由亞基α 和β 組成，根據(jù)亞基組成的不同，整合素種類多樣。目前在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)整合素24 種，由18個(gè)α 亞基和8 個(gè)β 亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合的形式構(gòu)成。整合素參與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的粘附、信息傳遞，還可介導(dǎo)細(xì)胞的增值、分化、凋亡等［10］。整合素受體可以作為靶點(diǎn)用于腫瘤顯像或疾病治療，目前研究應(yīng)用較多的整合素有αvβ3、αvβ5、α4β7、α4β1等，整合素受體作為一種分子顯像或治療靶點(diǎn)具有很大的應(yīng)用潛能［11-12］。有研究表明非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面高表達(dá)整合素α3。1991年Lam等［13］提出利用“一珠一肽鏈”的組合化學(xué)肽庫技術(shù)合成多肽分子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可以合成含有不同長度肽鏈的肽庫。郭琳瑯等［14］利用組合化學(xué)肽庫技術(shù)篩選出來一種能夠與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面整合素α3受體結(jié)合的小分子環(huán)肽cNGQGEQc，該環(huán)肽與肺癌細(xì)胞的結(jié)合可以被整合素α3βv 阻斷。李貴平等［6］對(duì)小分子環(huán)肽cNGQGEQc 的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，成功地將放射性核素99mTc、131I 標(biāo)記到環(huán)肽分子上并進(jìn)行SPECT 顯像研究，131I標(biāo)記的小分子環(huán)肽cNGQGEQc對(duì)肺腺癌NCIH1975 細(xì)胞具有良好的親和力及明顯的靶向抑制作用。而小分子鏈肽cNGQGEQc-L的氨基酸序列與環(huán)肽cNGQGEQc 完全相同，但是兩端半胱氨酸不形成二硫鍵，是鏈狀排列的結(jié)構(gòu)形式，鏈肽分子相對(duì)環(huán)肽合成更方便、更經(jīng)濟(jì)。

圖8 注射熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 后1、2和5 h荷瘤裸鼠體內(nèi)臟器組織的熒光顯像圖Fig.8 Fluorescence biodistribution maps of tumor-bearing nude mice at 1,2 and 5 hours after injection of fluorescence-labeled polypeptide FAM-cNGQGEQc-L

表1 熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 在荷瘤裸鼠體內(nèi)的T/NT比值（± s）Tab.1 Tumor/non-tumor(T/NT)ratios of fluorescencelabeled polypeptide FAM-cNGQGEQ-L in tumor-bearing nude mice(Mean±SD)

表1 熒光多肽FAM-cNGQGEQc-L 在荷瘤裸鼠體內(nèi)的T/NT比值（± s）Tab.1 Tumor/non-tumor(T/NT)ratios of fluorescencelabeled polypeptide FAM-cNGQGEQ-L in tumor-bearing nude mice(Mean±SD)

與1 h相比，*P＜0.05；與2 h相比，△P＜0.05

臟器大腦肺臟心臟肝臟脾臟腎臟胃十二指腸1 h 1.45±0.03 1.89±0.02 1.43±0.05 1.37±0.02 2.04±0.04 1.05±0.03 0.78±0.06 2 h 1.16±0.02*2.38±0.03*2.56±0.05*1.90±0.01*2.89±0.07*1.36±0.06*0.22±0.03*5 h 2.11±0.04*△2.53±0.06*3.42±0.08*△2.51±0.04*△3.95±0.03*△1.40±0.09*1.12±0.04*△

FAM 是一種常用的熒光素衍生物，內(nèi)含苯環(huán)結(jié)構(gòu)，是一種脂溶性物質(zhì)。FAM 在激發(fā)光源的照射下發(fā)射出綠色熒光，可通過熒光顯微鏡或者多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察熒光表達(dá)強(qiáng)度。若將FAM 與多肽分子連接，根據(jù)探測(cè)的熒光強(qiáng)度能夠間接反映多肽分子的結(jié)合程度。熒光多肽分子探針常溫下與細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，不需要加熱，而且相較于放射性核素探針，研究人員可以避免接受射線照射，減少輻射污染。本實(shí)驗(yàn)所需要的連接了FAM 的熒光探針FAMcNGQGEQc-L 經(jīng)過質(zhì)量檢測(cè)其化學(xué)純度均在98%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞體外熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熒光分子探針FAMcNGQGEQc-L 可以與A549 細(xì)胞結(jié)合，熒光多肽分子與細(xì)胞膜結(jié)合，并進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。流式細(xì)胞檢測(cè)儀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與熒光多肽探針孵育1 h，細(xì)胞的相對(duì)熒光結(jié)合強(qiáng)度隨著熒光多肽探針濃度的增加而增加，具有飽和性。采用4 倍濃度的多肽cNGQGEQc-L 進(jìn)行熒光多肽的抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示抑制效果顯著，在孵育時(shí)間內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均被抑制，證明熒光多肽與肺腺癌A549細(xì)胞的結(jié)合具有特異性。取注射熒光多肽探針的荷瘤裸鼠離體器官進(jìn)行觀察，荷瘤裸鼠活體成像顯示腫瘤能夠攝取熒光多肽，F(xiàn)AM-cNGQGEQc-L 熒光探針在5 h 的成像效果較好，熒光探針在腫瘤的熒光表達(dá)強(qiáng)度高于實(shí)體器官，如肝臟、脾臟、肺、心臟。熒光探針不但經(jīng)過泌尿系統(tǒng)排泄，在膽囊和胃腸道也可見較多熒光染料聚集，考慮除了多肽本身的因素外，可能還與連接的熒光素相關(guān)，因?yàn)闊晒馑厥且环N脂溶性物質(zhì)。離體臟器的活體成像結(jié)果表明，胃內(nèi)可見有明顯熒光染料濃聚，考慮可能是由于離體解剖過程中，鄰近十二指腸內(nèi)容物交叉污染導(dǎo)致。因此，仍有必要對(duì)該小分子多肽探針進(jìn)行改性修飾以利于其進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

綜上所述，利用熒光素連接cNGQGEQc-L 構(gòu)建熒光分子探針FAM-cNGQGEQc-L，體外、體內(nèi)熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熒光分子探針cNGQGEQc-L 可與肺癌A549細(xì)胞、肺癌移植瘤結(jié)合，能夠特異性靶向肺腺癌，因此小分子多肽cNGQGEQc-L 有望成為肺癌特異性診斷的新型分子探針。