不穩(wěn)定性心絞痛患者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究

不穩(wěn)定性心絞痛是由于冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定性斑塊的破裂伴發(fā)血栓形成引起的急性心血管事件，不穩(wěn)定斑塊的破裂是其發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。如何篩選出與不穩(wěn)定性心絞痛相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，敏感性更高、特異性更強(qiáng)，是心血管專業(yè)所面臨的重大課題[1-2]。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為其提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái)[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)是指一個(gè)生物體/組織/細(xì)胞所表達(dá)的整套蛋白質(zhì)，是研究特定組織在不同時(shí)空情況下全部蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的技術(shù)，有助于尋找疾病診治的新標(biāo)志物。血清標(biāo)本的取材相對(duì)簡(jiǎn)便，容易獲取，是較為理想的臨床樣本[4-7]，本研究以不穩(wěn)定性心絞痛患者的血清為研究對(duì)象，希望能找出與之相關(guān)的特異蛋白質(zhì)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象入選2018年1—11月在空軍特色醫(yī)學(xué)中心就診的患者，共200例，臨床懷疑冠心病（主要表現(xiàn)為異常心電圖、胸痛不適和/或心肌核素檢查異常），年齡45～75歲，所有患者行冠狀動(dòng)脈造影檢查，依據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果分為2組：造影陰性為正常對(duì)照組，冠狀動(dòng)脈有不同程度狹窄為不穩(wěn)定性心絞痛組，各100例。本研究獲得空軍特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并向患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器ProteoExtract-Albumin/IgC Removal Kit購(gòu)自德國(guó)Merck公司，Immobilized pH gradient IPG 4-7（17 cm）、immobilized pH gradient IPG 3-10（17 cm）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Human SAA ELISA試劑盒、Human Gelsolin ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，YM-3超濾膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，IPGphor等電聚焦儀購(gòu)自美國(guó)GE公司，Ettan DALT Ⅵ垂直平板電泳系統(tǒng)、Typhoon 9410掃描儀購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司，ABI 4800 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystcm公司。

1.3 方法應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳（2DEDIGE）和質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)不穩(wěn)定性心絞痛及冠狀動(dòng)脈正常人群各100例，行血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并選取2個(gè)具有代表性的差異蛋白應(yīng)用ELISA進(jìn)行驗(yàn)證。血清標(biāo)本的收集和處理純化、ELISA檢測(cè)急性期反應(yīng)蛋白血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）、凝溶膠蛋白（Gelsolin）的濃度均按照相關(guān)說(shuō)明書操作。差異凝膠雙向電泳和質(zhì)譜分析在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量變量以±s表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較2組患者在年齡、血壓、血糖、白細(xì)胞計(jì)數(shù)，是否合并糖尿病、高脂血癥，吸煙與否、阿司匹林、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥（ACEI/ARB）類藥物、β受體-阻斷藥應(yīng)用比例等各方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不穩(wěn)定性心絞痛組的男性患者比對(duì)照組多，高敏C反應(yīng)蛋白（high sensitive c-reactive protein，hs-CRP）水平及服用他汀類藥物比例明顯高于對(duì)照組，總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平低于對(duì)照組（表1）。

表1 2組懷疑冠心病患者的一般資料

圖1 不穩(wěn)定性心絞痛組和對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白譜的熒光重疊圖

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析用SDS-PAGE電泳圖比較原血漿和去除IgG和ALB的血漿，經(jīng)過(guò)處理的樣品已除去高豐度蛋白。2-DE凝膠分別經(jīng)過(guò)3個(gè)通道掃描（圖1），分析軟件為DeCyder6.5，對(duì)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度進(jìn)行差異比較，得到了32個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有19個(gè)點(diǎn)下調(diào)，13個(gè)點(diǎn)上調(diào)。利用制備膠分離蛋白樣品，經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，共鑒定到11種19個(gè)差異蛋白（表2），存在著翻譯后修飾的情況。SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶α-AT以及結(jié)合珠蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)的C4和C6前體發(fā)生上調(diào)。有載脂蛋白A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ，ApoA-Ⅳ及其前體，轉(zhuǎn)鐵蛋白11 kD、7 kD，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，細(xì)胞骨架的凝溶膠蛋白、凝溶膠蛋白-1亞基、Myosin-11，血紅蛋白β鏈和11 kDa亞基下調(diào)（表2）。

表2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分析對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析顯示，差異蛋白質(zhì)涉及到急性期反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞骨架、脂代謝和能量代謝等多種功能，其中急性期反應(yīng)蛋白占28.1%、脂代謝蛋白占12.5%、補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白占12.5%、細(xì)胞骨架蛋白占12.5%、能量代謝相關(guān)蛋白占16.7%、纖維蛋白占8.3%，其他功能未知蛋白占8.3%。

2.4 ELISA驗(yàn)證雙向凝膠電泳的定量結(jié)果為驗(yàn)證雙向凝膠電泳結(jié)果的可靠性，選取2個(gè)具有代表性的差異蛋白，急性期反應(yīng)蛋白-血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）和細(xì)胞骨架蛋白-凝溶膠蛋白（Gelsolin），并選取年齡和性別匹配的冠脈正常人（對(duì)照組）、穩(wěn)定性心絞痛（穩(wěn)定型心絞痛組）、不穩(wěn)定性心絞痛（不穩(wěn)定性心絞痛組）以及急性心肌梗死（急性心肌梗死組）患者各50例，應(yīng)用ELISA進(jìn)行。結(jié)果顯示，SAA2在冠狀動(dòng)脈正常組和穩(wěn)定心絞痛組患者中表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不穩(wěn)定性心絞痛組和急性心肌梗死組患者明顯高于對(duì)照組和穩(wěn)定性心絞痛組（P＜0.01），其中急性心肌梗死組最高（圖2）。Gelsolin在對(duì)照組、穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組和急性心肌梗死組中的表達(dá)水平逐漸減低，急性心肌梗死組最低（圖3）。

圖2 SAA2在血清中的表達(dá)

圖3 Gelsolin在血清中的表達(dá)

3 討論

本研究以不穩(wěn)定性心絞痛患者的血清為研究對(duì)象，采用2DE-DIGE-MS方法分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并應(yīng)用ELISA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11種19個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，涉及到急性期反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞骨架、脂代謝和能量代謝等。

3.1 急性期反應(yīng)蛋白SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶在不穩(wěn)定性心絞痛中上調(diào)。SAA2屬于急性期蛋白，在機(jī)體遭受創(chuàng)傷、手術(shù)、感染、燒傷等應(yīng)激時(shí)明顯升高，是反映體內(nèi)炎癥的敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）時(shí)機(jī)體伴有明顯的急性期反應(yīng)，SAA2上調(diào)，和既往文獻(xiàn)報(bào)道相一致[8]。銅籃蛋白是人體重要的亞鐵氧化酶，對(duì)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡起著重要作用。研究證實(shí)，銅藍(lán)蛋白能夠促進(jìn)體內(nèi)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的形成，在動(dòng)脈硬化進(jìn)展中起到一定的作用[9]。本研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定性心絞痛患者銅籃蛋白升高，說(shuō)明與其進(jìn)展有關(guān)。α-AT是主要炎性反應(yīng)蛋白之一，屬于蛋白酶抑制因子，在缺血再灌注損傷的急性期表達(dá)增高，已有多個(gè)研究報(bào)道α-AT和ACS密切相關(guān)[9]。

3.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的C4和C6前體表達(dá)上調(diào)補(bǔ)體系統(tǒng)是由血清/組織液中的一組可溶性蛋白及存在于血細(xì)胞表面的膜結(jié)合蛋白和補(bǔ)體受體所組成，大量事實(shí)證明補(bǔ)體系統(tǒng)與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程相關(guān)，可引起血小板聚集，脂質(zhì)及組織氧化過(guò)程[10]。在本研究中，C4B和C6前體表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明炎癥反應(yīng)可能參與了ACS的發(fā)生發(fā)展。

3.3 纖維蛋白升高纖維蛋白是體內(nèi)重要的凝血因子，血漿纖維蛋白水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度密切相關(guān)，是冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，纖維蛋白升高提示機(jī)體凝血相關(guān)蛋白異常，易致血栓形成，促進(jìn)不穩(wěn)定性心絞痛的發(fā)生發(fā)展。

3.4 ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅳ及其前體表達(dá)下調(diào)ApoA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白成分，ApoA-Ⅰ降低是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ApoA-Ⅳ是一種脂結(jié)合蛋白，主要作用是參與脂質(zhì)代謝，ApoA-Ⅳ通過(guò)介導(dǎo)HDL與肝細(xì)胞的結(jié)合以及被攝取，參與了膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[11]。本研究中不穩(wěn)定性心絞痛患者載脂蛋白均下調(diào)，說(shuō)明脂代謝紊亂在其發(fā)病中起到重要的作用。

3.5 轉(zhuǎn)鐵蛋白11 kD、7 kD下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白是由肝臟合成的一類結(jié)合球蛋白，主要生理作用是維持體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)，抑制LDL氧化修飾，從而減輕動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展[12]。本研究中轉(zhuǎn)鐵蛋白下調(diào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)鐵蛋白在ACS發(fā)病中可能起到一定的作用。

3.6 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種急性期負(fù)相蛋白，在機(jī)體內(nèi)起運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和代謝物等作用，本研究中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白下調(diào)，說(shuō)明ACS發(fā)生時(shí)可能伴有代謝失常。

3.7 組成細(xì)胞骨架Gelsolin、凝溶膠蛋白-1亞基下調(diào)凝溶膠蛋白是組成細(xì)胞骨架蛋白的重要成分之一，屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其主要功能是切割肌動(dòng)蛋白（actin），介導(dǎo)細(xì)胞外骨架重排，和粥樣斑塊的纖維帽厚薄有關(guān)。本研究顯示ACS患者Gelsolin下調(diào)，運(yùn)用ELISA的方法進(jìn)一步驗(yàn)證，說(shuō)明急性冠脈綜合征時(shí)凝溶膠蛋白下調(diào)，纖維帽變薄，進(jìn)一步促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了不穩(wěn)定性心絞痛發(fā)生發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，通過(guò)對(duì)差異蛋白的生物學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)急性期反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)及凝血相關(guān)蛋白的異常，載脂蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的降低，能量代謝紊亂等一系列的病理生理改變參與不穩(wěn)定性心絞痛的進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)了某些特異表達(dá)蛋白質(zhì)的改變，特別是細(xì)胞骨架蛋白，如凝溶膠蛋白的改變，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，可能為心絞痛的防治提供新靶點(diǎn)，雖然進(jìn)行了小樣本量的ELISA驗(yàn)證，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模臨床驗(yàn)證。