液相色譜法測定果汁飲料中甜蜜素的不確定度評定

裴波 何殷萍 歐敏先

綿陽市食品藥品檢驗(yàn)所 四川綿陽 621000

環(huán)己基氨基磺酸鈉，俗稱甜蜜素。它是食品生產(chǎn)中常用的一種人工合成的無營養(yǎng)性食品甜味劑。甜蜜素的甜味純正，甜度是蔗糖的30～40倍，由于甜度高、價格低廉等優(yōu)勢，曾被多國廣泛使用[1]。甜蜜素因長期存在是否具有致癌性的爭議，美國、日本等國家已不允許在食品中添加甜蜜素[2]。在我國，甜蜜素仍普遍使用于食品加工行業(yè)，并且在GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對甜蜜素的使用范圍和最大使用量都有明確規(guī)定，其中果汁飲料中甜蜜素（以環(huán)己基氨基磺酸計）的最大使用量為0.65g/kg[3]。

目前，在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中[4]，液相色譜法測定甜蜜素操作較繁瑣，引起測定結(jié)果不確定度因素較多，根據(jù)我國國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局頒布的國家計量技術(shù)規(guī)范《JJF1059-1999測量不確定度評定與表示》[5]和國際ISO出版的“測量不確定度表示導(dǎo)則”。本文對液相色譜法測定果汁飲料中甜蜜素含量的不確定度來源進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)

本文采用GB 5009.97-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》標(biāo)準(zhǔn)中第二法——高效液相色譜法進(jìn)行測定。

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜（LC-20AT 島津），配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器；分析天平（JJ500 常熟市雙杰測試儀器廠）。

1.1.2 試劑

環(huán)己基氨基磺酸鈉（純度≥99%）；正庚烷（色譜純）；乙腈（色譜純）；硫酸（分析純）；次氯酸鈉（分析純）；碳酸氫鈉（分析純）；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；

流動相：乙腈+水（70+30）；

流速：1mL/min；

進(jìn)樣量：10μL；

柱溫：40℃；

檢測器：二極管陣列檢測器；

檢測波長：314nm。

1.3 樣品處理

稱取果汁飲料25.0g，用水定容至50mL備用。準(zhǔn)確移取10.00mL備用液，加入2.00mL硫酸（1+1）溶液，5.00mL正庚烷和1.00mL次氯酸鈉溶液，劇烈振蕩1min，靜置分層，除去水層后在正庚烷層中加入25.00mL碳酸氫鈉（50g.L-1）溶液，振蕩1min，靜置取上層有機(jī)相，并經(jīng)0.45μm微孔有機(jī)相濾膜過濾，上機(jī)測定[1]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取1.00mg/mL環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mL，1.00 mL，2.50 mL，5.00 mL，10.00mL 至 50mL 容量瓶中，用水定容。移取10.00mL環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，加入2.00mL硫酸（1+1）溶液，然后同1.3進(jìn)行處理。

2 數(shù)學(xué)模型

2.1 數(shù)據(jù)采集計算轉(zhuǎn)化過程

（1）以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以環(huán)己基氨基磺酸鈉衍生物N，N-二氯環(huán)己胺峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用校準(zhǔn)直線回歸方程計算樣品中甜蜜素的含量?；貧w方程表示如下：

式中：

y——環(huán)己基氨基磺酸鈉衍生物N，N-二氯環(huán)己胺峰面積；

a——回歸方程的截距；

b——回歸方程的斜率；

x——目標(biāo)組分的濃度，單位μg.ml-1。

（2）利用式2計算樣品中甜蜜素的含量。

式中：

X——試樣中環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量，單位為克每千克（g.kg-1）；

C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出試樣定容溶液中環(huán)己基氨基磺酸鈉的濃度，單位為微克每毫升（μg.mL-1）；

V——試樣的最后定容體積，單位為毫升（mL）；

m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

1000——由μg.g-1換算成g.kg-1的換算因子。

不確定度分量分析及評定

2.2.1 樣品前處理的測量不確定度urel

2.2.1.1 分析天平的測量不確定度urel1

(1)分析天平示值誤差引入的測量不確定度urel1-1

校準(zhǔn)證書給出分析天平的允許誤差限為0.05g，用均勻分布計算，包含因子為√3。每個樣品，使用電子天平稱量的次數(shù)為4次，稱量過程都是相互獨(dú)立的，因而稱量過程的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式：

(n為不確定度分量的個數(shù))計算。

相 對 不 確 定 度 uare1l-1= u1/m×100=0.228%。（ 質(zhì) 量m=25.00g）

（2）分析天平的偏載誤差引入的測量不確定度urel1-2

校準(zhǔn)證書給出天平偏載允許誤差限為0.1g，按2.2.1中（1）中的計算方式進(jìn)行處理。每個樣品，使用電子天平稱量的次數(shù)為4次，計算得到：

相對不確定度ure1l-2= u2/m×100=0.440%。

（3）分析天平重復(fù)性引入的測量不確定度urel1-3

校準(zhǔn)證書給出天平偏載允許誤差限為0.15g，按2.2.1中（1）中的計算方式進(jìn)行處理。每個樣品，使用電子天平稱量的次數(shù)為4次，計算得到：

相對不確定度urel1-3=u3/m×100=1.360%。

（4）分析天平的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.1.2 使用的容量瓶引入的測量不確定度urel2

按照J(rèn)JG196《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中的要求，容量為50mL的A級單標(biāo)線容量瓶的最大示值允許誤差為0.05mL，每個樣品，共使用兩次。按2.2.1中（1）進(jìn)行處理：

2.2.1.3 使用的移液管引入的測量不確定度urel3

按照J(rèn)JG196《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中的要求及處理過程1.3產(chǎn)生的不確定度分量見表1：

表1 樣品處理過程移液管產(chǎn)生的不確定度

綜上可知，分析天平、容量瓶及移液管3個不確定度分量是相互獨(dú)立的，因而樣品前處理的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度用公式（3）進(jìn)行計算：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制的不確定度u′rel

根據(jù)1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)使用液的測量不確定度u′rel1

標(biāo)準(zhǔn)使用液使用容量瓶引入的測量不確定度u′rel1-1

單個50mL容量瓶的測量不確定度見2.2.1.2評定的結(jié)果，urel2=0.057%。由于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的5個容量瓶是相互獨(dú)立的，所以其合成不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)使用液使用的移液管引入的測量不確定度u′rel1-2

按照J(rèn)JG196《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中的要求及標(biāo)準(zhǔn)曲線配制所產(chǎn)生的不確定度分量見表2：

標(biāo)準(zhǔn)使用液的測量合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制中移液管所產(chǎn)生的不確定度

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量不確定度u′rel2

檢測中使用了國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的食品甜味劑環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，證書號GBW(E)100173，含量為10.00mg/mL，相對擴(kuò)展不確定度為Ur=1%（k=2）。則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量不確定度：

（3）配制1.00mg/mL儲備液的測量不確定度u′rel3

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液被稀釋成1.00mg/L儲備液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，引入了1mLA級單標(biāo)線移液管不確定度和10mLA級容量瓶不確定度。根據(jù)JJG196《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中的要求得：

1mLA級單標(biāo)線移液管的不確定度：

10mLA級容量瓶得不確定度：

配制1.00mg/mL儲備液的測量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（4）標(biāo)準(zhǔn)直線的測量不確定度u′rel4

3 結(jié)論

通過分析影響測量不確定度的各分量發(fā)現(xiàn)，影響液相色譜法檢測果汁飲料中甜蜜素的不確定度主要是樣品處理及校準(zhǔn)。因此，在測量樣品過程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，嚴(yán)格按照規(guī)定操作，并且高度重視校準(zhǔn)線型及校準(zhǔn)的控制，確保檢驗(yàn)結(jié)果的可靠[2]。