侯淑玲,朱雅君,劉靜遠(yuǎn),田沂民,謝小玨,于 翠,葉 軍,易建平
(上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)
橘臀紋粉蚧Planococcuscitris(Risso)又名橘粉蚧,隸屬于同翅目 Homoptera粉蚧科 Pseudococcidae臀紋粉蚧屬Planococcus,是熱帶、亞熱帶植物的主要害蟲[1],主要為害寄主植物的莖、葉片、花、果等幼嫩部位,輕者可使葉片變黃,重者干枯脫落,嚴(yán)重影響水果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞性植物的品相[2]。同時(shí),橘臀紋粉蚧與另一種重要的檢疫性粉蚧大洋臀紋粉蚧P.minor(Maskell)形態(tài)相近,且常在同一種寄主上混合發(fā)生,極易混淆,區(qū)分兩者難度較大,因此建立快速準(zhǔn)確鑒定橘臀紋粉蚧的方法十分必要。實(shí)時(shí)熒光PCR方法相較傳統(tǒng)PCR方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)有害生物的快速鑒定。本研究根據(jù)橘臀紋粉蚧穩(wěn)定的特異性片段設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光Taqman探針,并優(yōu)化反應(yīng)條件,以建立橘臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)橘臀紋粉蚧的快速鑒定。
供試樣品材料包括上海市浦東新區(qū)葡萄上采集的橘臀紋粉蚧,上海辰山植物園(簡(jiǎn)稱SCSBG)、云南省西雙版納熱帶植物園(簡(jiǎn)稱XTBG)蘭花上采集的橘臀紋粉蚧,以及上海海關(guān)(簡(jiǎn)稱SHCC)截獲標(biāo)本上的橘臀紋粉蚧。陰性對(duì)照為大洋臀紋粉蚧、南洋臀紋粉蚧P.lilacinus(Cockerell),為上海海關(guān)截獲樣本,具體信息見表1。所有標(biāo)本浸泡于無水乙醇中,保存于上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植檢實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱中。
表1 試驗(yàn)材料
從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載107條臀紋粉蚧屬線粒體COI基因序列,具體信息見表2。
表2 參考序列信息
使用DNeasy?Blood Tissue Kit(Qiagen,Germany)試劑盒從整頭成蟲樣品中提取DNA。PCR引物為PcoF1/LepR1[3]。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括:1 μL DNA模板(10 ng),引物各1 μL(5 μmol/L),5 μL dNTPs(10 mmol/L),5 μL 10×PCR buffer(含有Mg2+,TaKaRa Bio.Dalian,China),Taq DNA polymerase 2 U,ddH2O 37 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送北京六合華大基因科技有限公司上海分公司測(cè)序部雙向測(cè)序,測(cè)得PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為678bp。應(yīng)用CLUSTX和GENEDOC軟件將測(cè)序所得DNA序列與GenBank中下載序列進(jìn)行整理和比對(duì),尋找橘臀紋粉蚧穩(wěn)定的特異性序列,篩選適合于探針設(shè)計(jì)的片段。
實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系為25 μL(TaKaRa,Premix Ex TaqTM試劑盒):2×Premix Ex Taq 12.5 μL,50×ROX Reference Dye 0.5 μL,上下游引物(5 μmol/L)各1.0 μL,探針(10 μmol/L)1.0 μL,DNA模板2.0 μL,超純水補(bǔ)至25 μL。利用7500 Real-Time PCR System定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃ 5s,60℃ 30s,循環(huán)40次。每份樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù),陰性對(duì)照為大洋臀紋粉蚧及南洋臀紋粉蚧,空白對(duì)照為超純水。
將上海辰山植物園采集的樣品CS-1a的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,用數(shù)字進(jìn)行編號(hào),1—7號(hào)表示樣品CS-1a DNA模板濃度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍,每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)重復(fù),引物及探針、反應(yīng)條件同前,檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度。樣品CS-1a DNA初始濃度為6.33 mg/ μL。
通過比對(duì)橘臀紋粉蚧及幾個(gè)近似種的線粒體COI基因序列,最終確定在380 bp左右位置設(shè)計(jì)探針(圖1)。所有探針的熒光標(biāo)記信號(hào)均為FAM,引物分別為PCF3/PCR3,具體內(nèi)容見表3(引物和探針由上海基康公司合成)。
表3 橘臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針
橘臀紋粉蚧特異性探針PC-MGB對(duì)供試的24個(gè)橘臀紋粉蚧樣品均有強(qiáng)的熒光信號(hào)增加曲線,表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增,而陰性對(duì)照大洋臀紋粉蚧及南洋臀紋粉蚧樣品、空白對(duì)照則沒有檢測(cè)到熒光信號(hào),表現(xiàn)為陰性,部分樣品擴(kuò)增曲線參照?qǐng)D2。
熒光信號(hào)曲線如圖3所示,Ct值(Cycle threshold)分別為1號(hào)17.68、2號(hào)19.95、3號(hào)23.90、4號(hào)26.92、5號(hào)30.62、6號(hào)34.53、7號(hào)39.48。由于7號(hào)的Ct值>35,無法確定是否為陽性。所以,橘臀紋粉蚧特異性探針PC-MGB的檢測(cè)限位CS-1a的DNA濃度為6.33×10-5mg/ μL,即63.3 pg/ μL。
由于粉蚧科蟲體小,形態(tài)鑒別特征不明顯,往往需要豐富的經(jīng)驗(yàn)才能準(zhǔn)確鑒定。其種內(nèi)遺傳差異較小,相似度約98.5%—100%,同屬內(nèi)不同種間相似度約85%—93%,應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定粉蚧科昆蟲具有一定的可行性[4]。目前GenBank中有關(guān)粉蚧科的序列數(shù)為3 000余條,種類數(shù)為400余種,相比較粉蚧科全世界1 400余種差距較大,但隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的不斷增加,能夠鑒定的種類數(shù)將越來越多。許曉東[5]研究了憑祥口岸截獲的11種粉蚧及無花果蠟蚧的COI區(qū)域序列及28SD2區(qū)域序列,任競(jìng)妹[6]對(duì)粉蚧科23屬52種昆蟲進(jìn)行了DNA條形碼測(cè)序,研究結(jié)果均顯示DNA條形碼基本可以對(duì)粉蚧科昆蟲進(jìn)行有效的物種鑒定。但少數(shù)粉蚧科種內(nèi)遺傳差異較大,如Ferrisiavirgate種內(nèi)序列相似度為95.4%[7],而Ferrisia屬內(nèi)種間相似度可達(dá)95.9%,因此不能僅僅根據(jù)DNA條形碼技術(shù)對(duì)此種類型進(jìn)行最終鑒定,應(yīng)同時(shí)輔以形態(tài)學(xué)特征支持。除了DNA條形碼技術(shù)外,Saccaggi等[8]應(yīng)用多重PCR建立了區(qū)分橘臀紋粉蚧、無花果刺粉蚧Planococcusficus(Signoret)和擬長(zhǎng)尾粉蚧的方法;Rung等[9]基于RFLP技術(shù)建立了大洋臀紋粉蚧與橘臀紋粉蚧的檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)在植物有害生物快速檢測(cè)中是公認(rèn)的一種快速、穩(wěn)定、靈敏度高的方法。該方法多應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)中,在昆蟲檢測(cè)中應(yīng)用相對(duì)較少,Jones等[10]建立了區(qū)分B型和Q型煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法;Bass等[11]設(shè)計(jì)了三重?zé)晒馓结樣糜阼b定傳播瘧疾的按蚊及其近似種;另外,已針對(duì)5種實(shí)蠅建立了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[12]。但應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行粉蚧科昆蟲鑒定相對(duì)較少,徐浪等[13]應(yīng)用熒光PCR方法建立了大洋臀紋粉蚧和南洋臀紋粉蚧的快速檢測(cè)方法,為國(guó)內(nèi)首次將實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于蚧蟲種類鑒定,本文研究?jī)?nèi)容豐富了該領(lǐng)域研究?jī)?nèi)容,具有一定應(yīng)用價(jià)值。
橘臀紋粉蚧與大洋臀紋粉蚧不僅在外部形態(tài)上近似,分子水平上的差異也較小,依據(jù)單個(gè)基因位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)的特異性探針常易造成假陽性擴(kuò)增,這對(duì)橘臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光特異性Taqman探針的設(shè)計(jì)造成一定難度。本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)探針之時(shí),選擇了具有4個(gè)差異位點(diǎn)區(qū)段,并選擇了其中擴(kuò)增效率較高,同時(shí)重復(fù)性好的PCF3/PCR3作為擴(kuò)增引物,檢測(cè)準(zhǔn)確度高,分析簡(jiǎn)單快捷,可用于基層實(shí)驗(yàn)室橘臀紋粉蚧快速鑒定。且本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針檢測(cè)的最低樣本濃度可達(dá)pg級(jí)水平,靈敏度較高。值得注意的是,實(shí)際運(yùn)用時(shí)若Ct值在35—40,需濃縮待測(cè)樣品的DNA濃度,重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)。