煙草種子活力的復(fù)合逆境法研究

潘 威， 楊曉東， 杜景誠(chéng)， 喬 雨， 馬文廣,2

(1.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪 653100； 2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪 653100)

煙草種子作為煙葉生產(chǎn)中最基礎(chǔ)性的生產(chǎn)資料[1-3]，提高其質(zhì)量和科技含量是提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段。目前，煙草種子質(zhì)量主要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)的發(fā)芽率來(lái)檢測(cè)[4-5]，而發(fā)芽率僅代表種子是否具有生活力[6-7]，理想環(huán)境下是否能夠萌發(fā)，不能準(zhǔn)確反映種子在復(fù)雜育苗環(huán)境中實(shí)際出苗表現(xiàn)。而種子活力[8-10]是指可衡量高發(fā)芽率的種子批在廣泛的環(huán)境下出苗時(shí)不同方面的綜合特性，可準(zhǔn)確反映種子田間實(shí)際表現(xiàn)，以其為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可進(jìn)一步提升煙草種子質(zhì)量。復(fù)合逆境法(CSVT)是國(guó)外發(fā)展起來(lái)的一種種子活力測(cè)定新方法[11]，該法模擬種子出苗過(guò)程可能遭遇多重逆境，檢測(cè)種子逆境下萌發(fā)表現(xiàn)，相比其它種子活力測(cè)定方法，更符合國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)對(duì)種子活力的定義，更能體現(xiàn)種子活力全面狀態(tài)，且方法快速、簡(jiǎn)便，已有在玉米和小麥種子[12-13]上應(yīng)用的報(bào)道。而國(guó)內(nèi)外煙草種子活力檢測(cè)方法雖有報(bào)道[14-17]，但真正適于企業(yè)應(yīng)用的方法基本沒(méi)有，也沒(méi)有關(guān)于復(fù)合逆境測(cè)定煙草種子活力方法的研究報(bào)道。本研究模擬國(guó)內(nèi)煙區(qū)漂浮育苗過(guò)程常見低溫、低氧逆境，探索利用復(fù)合逆境法測(cè)定煙草種子活力可行性，以期為進(jìn)一步提升煙草種子質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)種子均取自玉溪中煙種子有限責(zé)任公司良種庫(kù)。包括：云煙85(2001-0164)、云煙85(2003-0144)、MS云煙85(2008-0927)、云煙105(2015-0030)、云煙105(2007-0010)、云煙105(2015-0059)、云煙97(2005-0228)、云煙97(2005-0178)、云煙97(2012-0971)、云煙87(2001-0064)、云煙87(2002-0138)、MS云煙87(2014-2882)、MSK 326(2004-0402)、MSK 326(2004-0387)、MSK 326(2013年)共5個(gè)品種，15份樣品，這些品種每年的全國(guó)種植面積合計(jì)超過(guò)80%以上，具有較高代表性。

1.2 研究地點(diǎn)與方法

1.2.1試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)均在玉溪中煙種子有限責(zé)任公司進(jìn)行。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽檢測(cè)

在培養(yǎng)皿中墊置2層濾紙，濕潤(rùn)，濾紙上均勻放置100粒煙草種子，每個(gè)批號(hào)3次重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每天光照12 h，發(fā)芽期間保持濾紙濕潤(rùn)。從第5天開始，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)目，以胚根正常、胚軸頂端(子葉)見綠為種子發(fā)芽計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)至14 d。第7天記錄種子發(fā)芽勢(shì)，第14天記錄種子發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Tt)(式中：Gt為不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)，Tt為發(fā)芽天數(shù))。

1.2.3種子復(fù)合逆境試驗(yàn)

取上述供試煙草種子，放入棉布袋中，扎緊袋口，整袋完全浸入水中，25 ℃浸種48 h，促使種子內(nèi)部各種生化過(guò)程啟動(dòng)，同時(shí)經(jīng)歷低氧脅迫，然后分別轉(zhuǎn)入5 ℃、2 ℃、1 ℃水中冷浸48 h，取出種子，吸干表面水分，25 ℃下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)樣品3次重復(fù)，在5 d、7 d、14 d進(jìn)行正常幼苗計(jì)數(shù)，5 d以見綠為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，7 d、14 d以2片子葉展開，幼苗正常為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算復(fù)合逆境處理后種子在5 d、7 d、14 d的發(fā)芽百分率，研究種子經(jīng)歷低溫、低氧脅迫后的發(fā)芽表現(xiàn)。

表1 不同煙草種子標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽結(jié)果及出苗率

品種 生產(chǎn)年份批號(hào)5d發(fā)芽勢(shì)/%7d發(fā)芽勢(shì)/%14d發(fā)芽率/%發(fā)芽指數(shù)出苗率/%MS云煙852001016452.67c79.00b83.33b15.18b52.37c云煙852003014481.00b92.67a95.00a18.33a71.90bMS云煙852008092790.00a96.33a97.67a19.16a90.52a云煙872001006472.67b88.00b89.00b17.10b75.33c云煙872002013872.33b91.67b93.00ab17.80b80.72bMS云煙872014288295.67a98.33a98.67a19.61a90.85a2004040257.00b69.00b73.00b13.66b53.59bMSK3262004038788.00a96.00a97.33a18.99a82.03a2013022992.33a96.00a97.33a19.21a88.24a2005022856.67b78.00b82.67b15.29b64.54c云煙972005017878.00ab88.67ab91.00ab17.57ab80.72b2012097191.67a97.67a99.33a19.43a88.89a2015003085.00a93.33b94.00b18.42b82.68b云煙1052007001085.33a94.67ab96.33ab18.73ab87.91ab2015005990.33a98.00a98.33a19.37a90.85a

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(p≤0.05)。下同。

1.2.4漂浮育苗出苗率檢測(cè)

由于全國(guó)煙區(qū)育苗時(shí)間、地點(diǎn)不同，育苗期間氣候、環(huán)境尤其是溫度則有一定差異。為保證漂浮育苗實(shí)驗(yàn)中設(shè)定溫度能較好反映煙區(qū)實(shí)際情況，出苗檢測(cè)結(jié)果具有較高代表性，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了云南、湖北、重慶、四川等煙區(qū)近4年來(lái)共計(jì)180份苗期育苗溫度，根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果將育苗溫度劃分為4個(gè)時(shí)間階段(00：00—06：00時(shí)為8 ℃、06：00—12：00時(shí)為20 ℃、12：00—18：00時(shí)為25 ℃、18：00—24：00時(shí)為12 ℃)。育苗用基質(zhì)采購(gòu)于玉溪果木林場(chǎng)，采用595孔漂盤，每孔1粒，育苗過(guò)程嚴(yán)格依照《烤煙漂浮育苗技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行，第22天以2片子葉展開，幼苗正常為判斷依據(jù)，統(tǒng)計(jì)出苗率，出苗率結(jié)果作為對(duì)應(yīng)批號(hào)種子活力的最終依據(jù)。

1.2.5差異顯著性分析和回歸分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行同一品種不同年份(批號(hào))種子間標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽結(jié)果、出苗率、復(fù)合逆境發(fā)芽結(jié)果的差異顯著性分析；利用Excel 2013軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽、復(fù)合逆境發(fā)芽與出苗率的線性回歸分析。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽及出苗率結(jié)果

出苗率是反映種子活力高低、質(zhì)量?jī)?yōu)劣最直接的依據(jù)，所有檢測(cè)指標(biāo)都需與之比較，以確定檢測(cè)方法的可靠性。由表1看出，同一品種3個(gè)批號(hào)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均由低到高排列，與對(duì)應(yīng)出苗率呈正相關(guān)關(guān)系，但發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均高于其田間實(shí)際出苗率，尤其是生產(chǎn)年份較早的種子，如云煙85-0144的7 d發(fā)芽勢(shì)為92.67%，但其出苗率僅為71.90%。同一品種中最早年份種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與后2個(gè)年份種子均存在顯著性差異，如MS云煙85-0164的7 d發(fā)芽勢(shì)較0144、0927分別相差13.67%、17.33%，差異達(dá)顯著水平；而同一品種中后2個(gè)年份之間的種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)差異均不顯著，如云煙85中0144的7 d發(fā)芽勢(shì)與0927僅相差3.66%。這與出苗率分析結(jié)果不一致，0144與0927的出苗率相差達(dá)到18.62%，差異達(dá)顯著水平。這種發(fā)芽指標(biāo)的差異分析結(jié)果與出苗結(jié)果不一致的情況也發(fā)生在云煙87、云煙97上?？偟膩?lái)說(shuō)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)與種子實(shí)際出苗結(jié)果總體趨勢(shì)一致，但不能準(zhǔn)確地反映所有批號(hào)種子實(shí)際出苗情況，尤其是不能區(qū)分出發(fā)芽指標(biāo)接近，但實(shí)際出苗表現(xiàn)有較大差異的種子批，無(wú)法有效代表種子活力。

表2 不同煙草種子復(fù)合逆境處理后發(fā)芽結(jié)果

品種生產(chǎn)年份批號(hào) 5℃處理發(fā)芽結(jié)果/%2℃處理發(fā)芽結(jié)果/%1℃處理發(fā)芽結(jié)果/% 5d7d14d5d7d14d5d7d14dMS云煙852001016417.33c65.33b73.67b64.67b68.00b70.00b17.00c71.00c74.00c云煙852003014469.00b74.00b76.67b66.67b70.00b71.67b81.67b88.00b88.00bMS云煙852008092787.67a90.33a95.33a89.00a91.67a92.00a92.33a94.00a95.00a云煙872001006475.33b79.00b83.00b77.67b79.67b82.67c73.67b80.00b82.00b云煙872002013875.67b78.67b83.67a78.67b83.67b88.00b82.00b87.67b87.67bMS云煙872014288292.67a95.33a95.33a93.33a94.00a94.00a96.33a97.33a96.67a2004040250.00b63.67b64.67b61.67b64.67c67.33c57.67b64.33b63.00bMSK3262004038789.00a89.67a94.33a88.67a89.00b89.33b88.00a93.33a94.33a2013022990.00a89.33a91.00a91.67a91.67a94.33a92.33a94.33a94.67a2005022848.00c68.33c76.00b51.67c65.33b73.00b48.00c64.33c63.00c云煙972005017867.00b81.00b86.67ab69.33b77.00b80.00ab72.00b79.00b80.00b2012097186.33a87.67a90.33a91.00a93.00a94.00a92.33a93.33a94.00a2015003087.00a90.00b91.67b82.33b84.33b84.67b85.33ab93.33ab92.67ab云煙1052007001090.67a93.33ab96.33a86.00b88.67b91.00a80.00b90.00b88.67b2015005992.67a97.67a97.67a93.67a96.00a94.33a95.67a97.00a96.33a

2.2 復(fù)合逆境法測(cè)定煙草種子活力

2.2.1不同冷浸溫度與統(tǒng)計(jì)時(shí)間下活力測(cè)定

復(fù)合逆境法先讓種子在常溫下吸脹48 h，促進(jìn)生理生化活動(dòng)啟動(dòng)，再經(jīng)歷低溫、低氧浸種48 h，生化活動(dòng)減緩，酶活降低，恢復(fù)理想發(fā)芽條件后，低活力的種子萌發(fā)緩慢甚至不能萌發(fā)，高活力種子則能夠更快恢復(fù)，正常萌發(fā)為健壯幼苗。煙草種子經(jīng)復(fù)合逆境處理后，萌發(fā)前期幼苗極小，統(tǒng)計(jì)困難，試驗(yàn)選擇計(jì)數(shù)結(jié)果可靠的5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽。比較5 d、7 d、14 d活力檢測(cè)結(jié)果，從差異顯著性來(lái)看，后2個(gè)批號(hào)出苗率存在顯著差異的品種云煙85、云煙87、云煙97，復(fù)合逆境處理后第5天、7 d發(fā)芽結(jié)果均有顯著差異，與出苗結(jié)果一致，但14 d結(jié)果并不理想，如5 ℃、2 ℃下，云煙97-0971與云煙97-0178的14 d發(fā)芽均無(wú)顯著差異，與出苗情況不一致。因此，復(fù)合逆境法5 d、7 d發(fā)芽結(jié)果評(píng)價(jià)種子活力比14 d更合適。從結(jié)果穩(wěn)定性上分析，生產(chǎn)年份較早、活力較低種子對(duì)復(fù)合逆境脅迫更為敏感，受影響更大，5 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果不夠穩(wěn)定，如MS云煙85-0164在5 ℃、2 ℃、1 ℃復(fù)合逆境下5 d發(fā)芽分別為17.33%、64.67%、17.00%，數(shù)據(jù)變化較大。即便在相同復(fù)合逆境處理溫度下，活力低的種子在5～7 d發(fā)芽結(jié)果變化也較大，如5 ℃下，MS云煙85-0164種子5 d發(fā)芽?jī)H為17.33%，明顯與實(shí)際出苗不符，至7 d發(fā)芽迅速提高至65.33%。相對(duì)來(lái)說(shuō)，不同活力水平的種子在不同溫度復(fù)合逆境處理后，7 d結(jié)果均較為穩(wěn)定，更適宜用于評(píng)價(jià)種子活力。

試驗(yàn)采用5 ℃、2 ℃、1 ℃低溫浸種脅迫種子，比較3個(gè)處理溫度結(jié)果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽，3個(gè)溫度復(fù)合逆境處理后，同一品種3個(gè)批號(hào)種子7 d發(fā)芽仍是由低到高排列，但受逆境脅迫影響，與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽比較均有所降低，尤其是同一品種中生產(chǎn)年份早，活力低的種子7 d發(fā)芽降低明顯；而生產(chǎn)年份晚的種子，降低幅度較小，這種變化與出苗率相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽結(jié)果的變化一致。從差異顯著性分析，5 ℃、2 ℃、1 ℃處理下，所有品種7 d 活力檢測(cè)結(jié)果的差異性與漂浮育苗出苗率均基本一致，均能有效區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽接近而出苗有差異的種子批，因此，最優(yōu)復(fù)合逆境溫度的確定還需要比較回歸分析結(jié)果。

2.2.2不同檢測(cè)指標(biāo)與出苗率回歸分析比較

如表3所示，5 d發(fā)芽勢(shì)、7 d發(fā)芽勢(shì)、14 d發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均與出苗率呈正相關(guān)，回歸系數(shù)R2分別為0.878 2、0.888 0、0.862 2、0.905 7，其中，發(fā)芽指數(shù)與漂浮育苗出苗率的回歸系數(shù)最大，發(fā)芽勢(shì)次之，發(fā)芽率最差。

比較復(fù)合逆境法不同統(tǒng)計(jì)時(shí)間與出苗的回歸系數(shù)，5 d發(fā)芽與出苗率相關(guān)性最低，R2在0.724 1～0.781 3之間；7 d最高，R2在0.829 4～0.908 4之間；而14 d相對(duì)7 d則略有降低，說(shuō)明7 d結(jié)果更能代表種子活力，這與差異顯著性分析結(jié)果一致。分析不同復(fù)合逆境溫度下種子7 d發(fā)芽與出苗率線性回歸系數(shù)，5 ℃比2 ℃、1 ℃線性回歸效果更好，相關(guān)性最高，R2達(dá)到0.908 4，比標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽條件下發(fā)芽指數(shù)的R2(0.905 7)更高。另外，發(fā)芽指數(shù)需要每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率后計(jì)算得出，而復(fù)合逆境處理只需統(tǒng)計(jì)第7天發(fā)芽結(jié)果即可，應(yīng)用在生產(chǎn)實(shí)踐中可極大縮減工作量與時(shí)間?？偠灾?，煙草種子經(jīng)25 ℃浸種48 h，5 ℃冷水浸種48 h，25 ℃下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，7 d發(fā)芽結(jié)果與出苗率呈顯著相關(guān)，可有效代表種子活力，效果優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽指標(biāo)。

表3 不同指標(biāo)與出苗率回歸分析結(jié)果

檢測(cè)方法檢測(cè)指標(biāo)回歸方程回歸系數(shù)R2標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽5d發(fā)芽勢(shì)y=0.8202x+14.010.87827d發(fā)芽勢(shì)y=1.3404x-42.280.888014d發(fā)芽率y=1.5257x-61.960.8622發(fā)芽指數(shù)y=6.4850x-36.790.9057復(fù)合逆境法5℃處理5dy=0.5078x+40.6760.72417dy=1.0670x-9.4310.908414dy=1.1860x-23.4850.90182℃處理5dy=0.8203x+14.14700.78137dy=1.0576x-8.18090.888014dy=1.2000x-22.29700.89931℃處理5dy=0.4993x+40.58100.76207dy=0.9877x-5.73360.829414dy=0.9694x-4.35670.8021

3 討 論

種子活力檢測(cè)的目的是預(yù)測(cè)其實(shí)際出苗表現(xiàn)，而其出苗表現(xiàn)受種子本身及出苗環(huán)境影響。所以，適宜的活力測(cè)定方法應(yīng)考慮可能遇到的播種條件。目前，國(guó)內(nèi)煙草雖多采用棚內(nèi)漂浮育苗方式育苗，但在春季氣候條件下播種，仍時(shí)常會(huì)遭遇低溫逆境，使煙草種子處于一段時(shí)間的低溫吸水階段，影響出苗質(zhì)量。復(fù)合逆境法就是模擬種子播種時(shí)的不良?xì)夂驐l件，首先在適溫條件下浸種，促進(jìn)種子內(nèi)部活化，萌發(fā)啟動(dòng)，隨后種子遭遇低溫，加之持續(xù)浸種帶來(lái)的缺氧環(huán)境，低活力的種子細(xì)胞膜完整性差，內(nèi)部活性物質(zhì)在浸泡中會(huì)損失，細(xì)胞膜系統(tǒng)也會(huì)優(yōu)于低溫浸種逐漸喪失生化控制功能，RNA、蛋白質(zhì)合成也會(huì)顯著降低，出現(xiàn)種子生理?yè)p傷，最終表現(xiàn)為恢復(fù)理想萌發(fā)環(huán)境后，仍不萌發(fā)或幼苗弱小，而高活力的種子在遭遇逆境后所受影響較小，恢復(fù)理想環(huán)境后，仍能較好較快生長(zhǎng)發(fā)育。因此，復(fù)合逆境活力檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于理想環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽指標(biāo)，能更好反映煙草種子復(fù)雜氣候環(huán)境下漂浮育苗實(shí)際結(jié)果。

4 結(jié) 論

研究以國(guó)內(nèi)種植面積較廣的云煙87、云煙85、MSK 326、云煙97、云煙105共計(jì)15個(gè)批號(hào)煙草種子為材料，探索了復(fù)合逆境法測(cè)定煙草種子活力的最優(yōu)條件及效果：

1) 不同逆境溫度比較，5 ℃處理后7 d發(fā)芽與種子出苗率回歸系數(shù)比2 ℃、1 ℃更高，且更易實(shí)現(xiàn)。

2) 在種子活力計(jì)數(shù)時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)上，7 d發(fā)芽與出苗率回歸系數(shù)比5 d、14 d更高，相關(guān)性更好，且能有效區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽接近而實(shí)際出苗差異較大的種子批?？傊?，煙草種子經(jīng)25 ℃快速吸脹48 h后，在5 ℃低溫浸種48 h，在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽條件下7 d測(cè)定發(fā)芽種子數(shù)，可有效代表煙草種子活力。與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽結(jié)果比較，回歸系數(shù)高，相關(guān)性更好。