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    石油降解菌的復(fù)配及降解效果評(píng)價(jià)*

    2020-07-08 01:23:08李小康杜明明屈撐囤
    油田化學(xué) 2020年2期
    關(guān)鍵詞:活性劑菌群原油

    李小康,魚 濤,李 紅,杜明明,屈撐囤,2

    (1.西安石油大學(xué)陜西省油氣田環(huán)境污染控制技術(shù)與儲(chǔ)層保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710065;2.石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

    0 前言

    石油烴化合物作為不同行業(yè)的主要能源和材料,由于用途較廣、使用量大,導(dǎo)致石油類物質(zhì)每年大量流入土壤和水體中,對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響[1-2]。石油物質(zhì)引起污染的途徑很多,主要包括石油大規(guī)模生產(chǎn)、運(yùn)輸、煉制、航運(yùn)活動(dòng)、意外溢油等[3]。若不及時(shí)治理,這些污染會(huì)不斷向周圍環(huán)境擴(kuò)散,并在新的環(huán)境中積累而達(dá)到較高的污染水平,給環(huán)境中的生命構(gòu)成直接或間接的健康危害[4-5]。石油污染物被列為污染廣泛的有毒化合物[6]。近年來,對(duì)石油污染物的控制已成為環(huán)境保護(hù)的重要問題[7]。因此,以環(huán)保和健康為宗旨清潔這些石油污染是非常必要的,廣大學(xué)者已研究并總結(jié)出一系列治理污染的技術(shù)[8]。相比于物理和化學(xué)的修復(fù)方法,生物處理是一種費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好的處理方法[9-10],不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生有害影響。但由于微生物修復(fù)的效率普遍較低,嚴(yán)重阻礙了微生物修復(fù)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用,同時(shí),降解石油污染的過程復(fù)雜多樣,不同菌株對(duì)原油的降解效果也各有差異,不同的環(huán)境條件和菌株間的相互作用也會(huì)影響原油的降解效果[11-12]。本文主要針對(duì)陜西定邊油田附近石油污染土壤的修復(fù)構(gòu)建高效的混合菌群,分析了它們的降解能力和降解過程中菌劑的組合配比,找尋提高它們降解能力的方法,為后續(xù)工程實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 材料與儀器

    含菌土壤:挖掘陜西定邊與靖邊油田附近的原油污染土壤表層10數(shù)20 cm的土壤,經(jīng)自然風(fēng)干,破碎研磨、混勻、過0.85 mm 篩后密封,用于降解菌的分離與富集。

    營(yíng)養(yǎng)原油培養(yǎng)基:將4.8 g K2HPO4·3H2O、1 g(NH4)2SO4、1.5 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O,0.5 g Na3C6H5O7·2H2O、0.1 g酵母粉和0.002 g CaCl2·2H2O 逐一加入超純水中進(jìn)行溶解,定容到1000 mL,用2 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0數(shù)7.2,制成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。取營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基100 mL,定量加入0.2 g原油(含飽和烴81.58%、芳香烴7.86%、膠質(zhì)7.26%、瀝青質(zhì)1.06%,回收率97.76%),將培養(yǎng)基置于121℃下高壓滅菌25 min。

    LB 培養(yǎng)基:將10 g 蛋白胨、10 g NaCl 和5 g 酵母浸粉加入1000 mL的超純水中進(jìn)行溶解,制備LB培養(yǎng)基。

    DNP-9272A型恒溫培養(yǎng)箱,常州恒隆儀器有限公司;LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;OIL-460型紅外分光測(cè)油儀,北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司;JYW-200A 型表面張力測(cè)定儀,承德金和儀器制造有限公司;SPX-150 GH型隔水培養(yǎng)箱,北京科偉永興儀器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 石油降解菌株的篩選與分離

    將2.0 g預(yù)處理后的含菌土樣加入100 mL的含2 g/L 原油的營(yíng)養(yǎng)原油培養(yǎng)基中,在150 r/min、30℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新鮮營(yíng)養(yǎng)原油培養(yǎng)基中振蕩富集培養(yǎng)7 d,重復(fù)4次。使用稀釋涂布平板法培養(yǎng)單個(gè)菌落,培養(yǎng)2數(shù)4 d 左右,挑取菌落特征明顯的單一菌落進(jìn)行編號(hào)保存。

    1.2.2 生理生化特性鑒定及分子生物學(xué)鑒定

    根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]提供的方法對(duì)已保存菌株進(jìn)行生理生化和形貌的分析鑒定。對(duì)純化的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA 的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,建立和表征不同種屬的細(xì)菌種類。利用通用引物為模板對(duì)菌株 進(jìn)行16S rRNA 基因的擴(kuò)增,通用引物為[15]:27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492 R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。

    具體反應(yīng)體系為:Template(基因組DNA 20數(shù)50 ng/μL)0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mM)1 μL,酶0.2 μL,F(xiàn)(10 uM)0.5 μL,R(10 uM)0.5 μL,加雙蒸H2O 至25 μL,總反應(yīng)體系共30.2 uL。PCR 擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃4 min;30 cycle 94℃45 sec,55℃45 sec,72℃1 min;72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并在NCBI進(jìn)行比對(duì)分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 菌株的生長(zhǎng)特性分析

    向12 支試管中分別加入5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基,在121℃下滅菌30 min,使用接種環(huán)接種篩選的石油降解菌(600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值OD600=0.5),并標(biāo)注編號(hào),放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱在35℃、180 r/min條件下培養(yǎng),每6 h取樣1次,使用可見分光光度法測(cè)定吸光度值,并求出OD600值[16]。使用原油培養(yǎng)基探究菌株以石油為碳源情況下的生長(zhǎng)狀況,由于培養(yǎng)基中原油在6 h 左右會(huì)被細(xì)菌乳化,故不能采用分光光度法測(cè)量細(xì)菌的OD600值,選用平板涂布法[17]測(cè)定不同時(shí)間下的菌數(shù)。

    1.2.4 原油降解率的測(cè)定

    在100 mL 的原油培養(yǎng)基中加入0.2 g 原油,滅菌后繼續(xù)加入3%接種量的純化菌液(OD600=0.6),并設(shè)置2個(gè)平行樣和空白對(duì)照,在37℃、180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)7 d 后,使用四氯化碳萃取剩余的原油,使用紅外測(cè)油儀測(cè)定剩余的總石油烴的量。利用所測(cè)數(shù)據(jù)按照式(1)計(jì)算原油降解率:

    其中,ν—原油降解率;c1—無菌對(duì)照樣品中原油的總烴類含量,mg/L;c2—接菌樣品中原油的總烴類含量,mg/L。

    1.2.5 單菌降解殘余烴類組成分析

    用CH2Cl2萃取細(xì)菌降解7 d 后的原油培養(yǎng)基,使用無水Na2SO4除去萃取液中殘余水分后進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件:色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm;進(jìn)樣口溫度250℃,載氣為高純度He氣,流速1 mL/min;在80℃下保持5 min,然后以6℃/min升溫速率升至180℃,保持2 min,再以10℃/min 的升溫速率升至300℃,保持10 min;分流比為10∶1。

    1.2.6 復(fù)配菌株對(duì)原油降解效果分析

    如表1所示,采用A-3、D-5、C-2這3株原油降解菌株進(jìn)行正交試驗(yàn),培養(yǎng)基中原油濃度為2 g/L,在溫度35℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 下降解反應(yīng)7 d。通過正交試驗(yàn)和SPSS 主體間效應(yīng)分析,探究復(fù)合菌加量對(duì)原油降解率的影響,找到最佳復(fù)配比例。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

    2 結(jié)果與討論

    2.1 菌株的分離與鑒定

    菌株經(jīng)過多次的轉(zhuǎn)接、篩選、純化后,分離出5株對(duì)原油降解作用明顯且活性較高的石油降解菌D-5、C-2、A-3、D-3、D-1,其生理生化特性如表2 所示。使用MEGA7 軟件對(duì)A-3、D-5、C-2 的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,結(jié)果如圖1所示。

    2.2 菌株的生長(zhǎng)狀況

    分離的不動(dòng)桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3、黏質(zhì)沙雷氏菌屬D-3、纖維單胞菌D-1 在LB培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。分離的5種菌株生長(zhǎng)狀況各有差異,其中A-3、C-2的生長(zhǎng)狀況最好,對(duì)數(shù)期菌株增長(zhǎng)較快,A-3、C-2和D-5分別在25、30和30 h 左右達(dá)到穩(wěn)定期。A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的混合菌群E 在LB 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線也見圖2?;旌暇鶨呈現(xiàn)S型增長(zhǎng)趨勢(shì),細(xì)菌生長(zhǎng)量也達(dá)到較高水平,在LB 培養(yǎng)基中45 h 時(shí)OD600值達(dá)到1.94,在原油培養(yǎng)基中菌數(shù)達(dá)到4.3×1015個(gè)/mL。Cornforth D M等[18]研究表明,當(dāng)混合菌生長(zhǎng)曲線為S 型增長(zhǎng)時(shí),菌株之間將不存在拮抗作用。因此可以將A-3、C-2、D-5這3株細(xì)菌作為混合菌降解石油污染物。D-3、D-1 的生長(zhǎng)量較低,這可能是由于培養(yǎng)基本身不適合該細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。張東升等[19]研究認(rèn)為,細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的適應(yīng)能力和生長(zhǎng)狀況各有不同,有些培養(yǎng)基還會(huì)抑制微生物自身生長(zhǎng)代謝,降低微生物活性。分離的D-5、C-2、A-3、D-3、D-1 等5 種菌株和A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的菌混合菌群E在原油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖3所示?;旌暇篍在培養(yǎng)基中依然表現(xiàn)出較高的細(xì)菌生長(zhǎng)量,D-5、A-3 也呈現(xiàn)較好增長(zhǎng)的趨勢(shì),C-2 相比于D-3、A-1 生長(zhǎng)趨勢(shì)也較好。綜合可得,A-3、C-2、D-5 這3 株細(xì)菌無論是在獨(dú)立條件還是混合條件下,在原油中均表現(xiàn)出很高的生物活性,可以用作治理石油污染的修復(fù)菌劑。

    表2 分離菌株形態(tài)與生理生化鑒定

    圖1 菌株16S rDNA基因序列發(fā)育樹

    圖2 菌株在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

    圖3 菌株在原油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

    2.3 細(xì)菌對(duì)原油的降解效果

    細(xì)菌D-5、C-2、A-3、D-1和混合菌群E對(duì)原油的降解率如圖4所示。由圖4可見,D-5和A-3對(duì)原油的降解效率均達(dá)到60%以上,C-2 對(duì)原油的降解率也達(dá)到39.36%。D-3由于降解過程中會(huì)將水中分散的原油聚集成為不溶于水和有機(jī)溶劑的團(tuán)狀物質(zhì),無法使用紅外測(cè)油儀測(cè)定降解率,夾出水中團(tuán)塊物質(zhì)后水中含油量幾乎為0。分析可能是細(xì)菌自身分泌的一些胞外物質(zhì)對(duì)原油產(chǎn)生了聚集包覆作用[20]?;旌暇篍 對(duì)石油的降解率最高,可能是微生物之間的協(xié)同作用改善了原油的疏水性和乳化性,增強(qiáng)了微生物對(duì)原油的利用效率[21],具體情況有待進(jìn)一步研究。結(jié)合圖3 可知,混合菌在相同培養(yǎng)環(huán)境下的生長(zhǎng)量比其它菌株的略高,也反映出微生物對(duì)石油的利用率增強(qiáng)。

    圖4 各菌株7 d后對(duì)原油的降解率

    2.4 殘烴的GC-MS分析

    單菌(OD600=0.6)和混合菌E 在2 g/L 石油含量的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中反應(yīng)7 d 后,萃取剩余油相進(jìn)行GC-MS 分析,結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知,A-3、D-5 和混合菌E 可以高效地降解原油組分中的C16、C17、C18、C19、C21、C44等烴類,且都表現(xiàn)出較強(qiáng)的石油降解能力;而D-1、C-2降解石油組分的能力相對(duì)較低。

    2.5 菌株的乳化能力和表面活性劑對(duì)菌株降解能力的影響

    篩選產(chǎn)表面活性劑菌株的方法較多,不同菌株分泌的表面活性劑種類不同,單一方法不能準(zhǔn)確測(cè)定菌株分泌表面活性劑的能力[22-23]。表3 為血平板乳化實(shí)驗(yàn)和菌株降解后培養(yǎng)液表面張力的測(cè)定結(jié)果。將5種菌株接種到血平板上,在20℃下經(jīng)過2 d的恒溫培養(yǎng),只有A-3、D-5 生成了大小不同的透明乳化圈,且發(fā)酵液的表面張力的差異不大??赡苁怯捎谘桨迮囵B(yǎng)基不能很好地促進(jìn)菌株生成表面活性劑。其他3 種菌株均未產(chǎn)生透明的乳化圈,發(fā)酵液表面張力基本接近空白培養(yǎng)基的表面張力,因此菌株對(duì)培養(yǎng)基中原油的降解率低[24]。

    圖5 各菌株降解原油后剩余組分的GC-MS分析

    向培養(yǎng)基中加入4 mL的質(zhì)量濃度為10 g/L的表面活性劑Tween 80,降解反應(yīng)7 d后單菌對(duì)原油的降解率如表4所示。結(jié)果表明,向培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween 80后,5株細(xì)菌對(duì)原油的降解率均有所提高,其中C-2對(duì)原油的降解率提升最高,達(dá)到70.84%。

    表3 各菌株分泌表面活性劑的能力

    表4 各菌株在有Tween80的情況下對(duì)原油的降解率

    2.6 高效降解菌群的復(fù)配

    不同菌株降解原油中各組分物質(zhì)的效率和方式存在差異,菌株之間也會(huì)相互影響,當(dāng)菌株之間相容性較高或存在協(xié)同關(guān)系時(shí),混合菌群能發(fā)揮最大的降解作用。研究表明,混合菌株投加比例合適時(shí),會(huì)進(jìn)一步提高細(xì)菌的降解效率[25-26]。D-5、C-2和A-3按不同比例混合的混合菌對(duì)原油的降解率見表5,SPSS主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果分析見表6。由表5可知,混合菌群在D-5、C-2 和A-3 之間的最佳接種比例5∶1∶5時(shí)對(duì)石油的降解效果最好。結(jié)合表6主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的Sig 值(0.05<D-5<A-3<C-2,即0.05<0.129<0.354<0.502)來看,3株菌對(duì)原油降解率均不產(chǎn)生顯著性影響,但混合菌群能有效地降解原油,說明各菌群對(duì)石油的降解均起到一定作用,其中D-5 對(duì)石油污染物的降解效果影響最大,其次是A-3、C-2。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在最佳條件(溫度35℃、pH 7.5、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、菌液加量6 mL)下,最佳接種比例的混合菌群在原油培養(yǎng)基中對(duì)原油的降解率達(dá)到74.18%。

    表5 菌株復(fù)配正交試驗(yàn)與極差分析

    表6 SPSS主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果分析

    2.7 Tween80加量對(duì)菌株降解能力的影響

    通過以上探究發(fā)現(xiàn),加入Tween80 可以明顯提升菌株對(duì)原油降解能力。表面活性劑對(duì)原油有較強(qiáng)的乳化作用,適量加入會(huì)提高微生物自身的活性,增強(qiáng)對(duì)原油的降解,但加入過量的表面活性劑會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用[27]。研究表明[28-29],投加的表面活性劑未達(dá)到臨界膠束濃度cmc 前,疏水性有機(jī)化合物的溶解性不能得到顯著提升。通過“拉環(huán)法”測(cè)定了加有不同量的Tween80 原油培養(yǎng)基的表面張力,結(jié)果見圖6。經(jīng)測(cè)Tween80 在原油培養(yǎng)基中的cmc值為30 mg/L,此時(shí)培養(yǎng)基的表面張力趨于穩(wěn)定。為了進(jìn)一步提高復(fù)配菌株對(duì)原油的降解效率,考察了不同Tween 80加量下復(fù)配菌株對(duì)原油的降解速率,結(jié)果見圖7。當(dāng)培養(yǎng)基中Tween 80 加量為30 mg/L(1 cmc)時(shí),降解7 d后混合菌群對(duì)原油的降解效果低于未添加Tween 80的,當(dāng)Tween 80加量為150 mg/L(5 cmc)時(shí),降解7 d 后混合菌群對(duì)原油的降解效果高于未添加Tween 80的,降解率達(dá)到了87.12%,能很好地應(yīng)用于石油污染的修復(fù)。

    圖6 Tween80在培養(yǎng)基中的cmc值測(cè)定

    圖7 Tween80加量對(duì)菌群降解效果影響

    3 結(jié)論

    從陜北定邊、靖邊油田原油污染土壤中篩選的原油降解菌中不動(dòng)桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3對(duì)原油的降解率分別為61.46%、39.36%和62.42%,其中,D-5、A-3 可降解原油中大分子烴類,降解作用明顯,C-2 的生物活性高,與菌株A-3、D-5 有較好的相容性,在表面活性劑作用下降解效果顯著。將這3 種菌株進(jìn)行復(fù)配,復(fù)配后的混合菌在LB 培養(yǎng)基中45 h 時(shí)OD600值達(dá)到1.94,在原油培養(yǎng)基中菌數(shù)達(dá)到4.3×1015個(gè)/mL,比單菌數(shù)量有所提升。在溫度為35℃、pH 為7.5、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、復(fù)配菌劑加量比D-5∶C-2∶A-3 為5∶1∶5、加量為6%、表面活性劑Tween80 濃度為150 mg/L 時(shí),混合菌的降解效果可達(dá)到87.12%,能很好地應(yīng)用于石油污染的修復(fù)。

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