促紅素新型環(huán)性衍生肽對順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的保護作用*

王 鋒，王熙堅，戴厚永，范亞平，楊 斌

（南通大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇226001）

隨著抗腫瘤藥物、抗生素、造影劑等的廣泛應(yīng)用，藥物引起的急性腎損傷（AKI）呈逐年上升趨勢。順鉑是很多實體腫瘤化療方案的基本藥物，抗腫瘤效率高，但順鉑及其代謝物可通過有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白被腎小管上皮細胞吸收，誘導(dǎo)腎小管上皮細胞的凋亡和壞死，從而導(dǎo)致AKI，有效緩解順鉑的腎毒性可以提高腫瘤患者的化療質(zhì)量[1]。促紅素新型線性衍生肽（helix B surface peptide，HBSP）對順鉑所致AKI 的保護作用在動物模型中已得到驗證[2]，本研究通過探討促紅素新型環(huán)性衍生肽（cyclic helix B peptide，CHBP）對順鉑誘導(dǎo)的 NRK-52E 損傷的影響及其可能的作用機制，為臨床緩解順鉑腎毒性提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 NRK-52E 細胞（由南京醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科贈送）；CHBP（上海科肽生物科技有限公司）；順鉑注射液（6 mL：30 mg）（中國江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司）；DMEM-F12 培養(yǎng)基（美國HYCLONE 公司）；小牛血清（德國CapricornScientific公司）；PBS、青鏈霉素溶液（中國碧云天生物有限公司）；0.25%胰酶-EDTA（美國THERMO 公司）；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（中國凱基生物有限公司）；流式細胞儀（BriCyte E6）（中國mindray公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：體外培養(yǎng)NRK-52E 細胞分為三大組，（1）對照組：NRK-52E 細胞（4×105）單純培養(yǎng)；（2）順鉑組：10 μmol/L 順鉑處理 NRK-52E 細胞；（3）CHBP 干預(yù)組：①低濃度亞組：16 nmol/L CHBP+10 μmol/L 順鉑處理NRK-52E 細胞；②中濃度亞組：32 nmol/L CHBP+10 μmol/L 順鉑處理 NRK-52E細胞；③高濃度亞組：64 nmol/L CHBP+10 μmol/L 順鉑處理NRK-52E 細胞。每組分別干預(yù)12 h、24 h。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：NRK-52E 細胞常規(guī)復(fù)蘇，用含10%小牛血清、1%青鏈霉素溶液的DMEM-F12 完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶（含EDTA）消化并傳代。NRK-52E 細胞以 5×105個/孔接種于6 孔板，每孔加完培至2.5 mL，培養(yǎng)24 h，此時NRK-52E 貼壁60%～70%，細胞形態(tài)良好。順鉑組加10 μmol/L 順鉑處理，干預(yù)組按照分組分別給予16、32、64 nmol/L CHBP 處理，再加 10 μmol/L 順鉑，分別誘導(dǎo) 12 h、24 h。

1.2.3 檢測方法：采用Annexin V-FITC-PI 法檢測各組細胞凋亡情況。每孔去上清后用0.5 mL 不含EDTA 的0.25%胰酶消化，顯微鏡下觀察，待貼壁細胞脫落后每孔加入1 mL 完培終止消化。收集細胞，PBS 洗滌 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 懸浮細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫、避光，反應(yīng) 15 min，上流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以表示，組間差異性比較采用單因素方差分析、LSD 法及t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

對照組12 h 凋亡率與24 h 的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；順鉑組 24 h 凋亡率較 12 h 增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在 12 h 和 24 h，順鉑組凋亡率高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在12 h，低濃度亞組凋亡率與順鉑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CHBP 干預(yù)中、高濃度亞組的凋亡率低于順鉑組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在24 h，各濃度亞組凋亡率低于順鉑組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 各組細胞凋亡率比較 %

3 討 論

AKI 是指3 個月內(nèi)腎臟結(jié)構(gòu)或功能的異常，包括血、尿、組織檢測或影像學腎損傷標志物異常。臨床診斷標準為腎功能突然減退，48 h 內(nèi)血肌酐（Scr）升高絕對值＞25 μmol/L（3 mg/L）或較基礎(chǔ)值升高＞50%或尿量減少（＜0.5 mL/kg·h，超過 6 h）[3]。流行病學調(diào)查顯示，AKI 發(fā)生率不斷升高，病死率依然居高不下，盡管對AKI 的認識不斷深入，支持或輔助治療措施也有進展，但缺乏早期特異有效的治療措施，預(yù)后仍惡劣。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

國內(nèi)外對AKI 病因研究，主要集中在缺血再灌注、膿毒癥以及腎毒性。順鉑作為抗腫瘤一線藥物，是患者發(fā)生藥物性AKI 最常見的原因之一。順鉑腎損傷機制牽涉多因素的共同作用，可以通過對腎小管、腎血管的直接毒性作用，改變腎血流量和腎小球濾過率；可誘導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)以及腎間質(zhì)纖維化；也可通過各種細胞通路、細胞因子、信號分子傳遞引起腎臟的炎癥、凋亡和壞死，從而直接損傷腎小管上皮細胞[4]。順鉑對腎臟的損傷作用具有劑量依賴性，如何最大程度減少其腎毒性而達到腫瘤最大治療效應(yīng)，成為目前研究的熱點。有研究表明，抗氧化劑及許多巰基配體如Dendropanax morbifera、SRT1720、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、4-亞甲藍基安息香酸、金屬硫蛋白等對順鉑所致腎毒性具有一定保護作用[5-7]。

近年國內(nèi)外報道EPO 具有顯著的腎組織保護作用，對AKI 有較好的防治效果，但動物實驗和臨床研究顯示，EPO 啟動腎臟保護作用需高劑量，由此產(chǎn)生的高血壓、血栓形成等諸多不良反應(yīng)極大限制了EPO 的臨床應(yīng)用。找到EPO 組織保護作用的位點可特異性地避免其不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟及其他器官中存在 β-共同受體（βcR，CD131），系 GMCSF、IL-3 和IL-5 受體共同亞單位，能與EPO 受體（EPOR）形成異源二聚受體，減輕炎性反應(yīng)和抑制細胞凋亡，發(fā)揮組織保護作用，它有別于經(jīng)典EPO 同源二聚受體，并不啟動造血信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Brines 等[8]應(yīng)用蛋白構(gòu)象技術(shù)的研究表明，EPO 由4 個螺旋結(jié)構(gòu)（Helix A-D）連接成環(huán)，當EPO 與其同源二聚受體結(jié)合時，Helix B 的親水表面并不與其接觸。研究證實βcR 的配體為Helix B，進而在Helix B 螺旋親水表面挑選出11 個氨基酸殘基，人工合成線性多肽鏈（HBSP），即新型促紅素衍生肽，達到促紅細胞生成與組織保護作用分離的目的。HBSP 在動物模型中初步顯示出良好的腎保護作用，而無促紅細胞生成的副作用。我們前期研究也證實HBSP 通過抑制炎癥反應(yīng)以及細胞凋亡，達到對順鉑所致AKI 的腎臟保護作用。

本研究結(jié)果顯示，腎小管上皮細胞經(jīng)順鉑處理，隨著作用時間的延長，腎小管上皮細胞早期凋亡率增加，間接證實順鉑對腎小管上皮細胞的毒性早期存在時間依賴性。采用CHBP 進行干預(yù)，12 h 內(nèi)中、高濃度CHBP 對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡具有抑制作用，但低濃度CHBP 效果欠佳。24 h 后低、中、高濃度CHBP 均能有效抑制順鉑引起的腎小管上皮細胞凋亡，隨著CHBP 濃度增加，腎小管上皮細胞凋亡率下降。

綜上所述，本研究證實CHBP 可以通過抑制細胞凋亡，發(fā)揮對順鉑所致AKI 的保護作用，其效應(yīng)與作用時間以及劑量呈正比。這為臨床AKI 治療提供新的思路，但如何應(yīng)用于臨床，仍需進一步深入研究。