藻菌共生小球的制備及其脫氮效能

■李科靜 周詩琪 聶凌云 葛燕婷 余建波 李德亮

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要組成部分，在提供優(yōu)質(zhì)動物蛋白和改善居民膳食結(jié)構(gòu)方面做出了突出的貢獻(xiàn)。2019年，全年水產(chǎn)品產(chǎn)量6,450萬t，其中養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量5,050萬t，養(yǎng)殖產(chǎn)量連續(xù)30年穩(wěn)居世界第一（2019年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)）。近年來，隨著產(chǎn)業(yè)集約化和規(guī)?；潭鹊牟粩嘣鰪?qiáng)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對水域環(huán)境的潛在威脅日益受到政府和社會的高度關(guān)注。氨氮和亞硝酸鹽氮不僅是養(yǎng)殖尾水排放監(jiān)管的兩大重要指標(biāo)，而且高濃度的氨氮和亞硝酸鹽能損害養(yǎng)殖對象的組織結(jié)構(gòu)、生理特征和代謝能力，從而導(dǎo)致大量死亡。隨著國家水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水污染物排放相關(guān)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的相繼出臺，養(yǎng)殖水體的綜合治理與修復(fù)將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)日常管理的重要內(nèi)容之一，研發(fā)養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽原位修復(fù)技術(shù)和養(yǎng)殖尾水異位凈化技術(shù)也必將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所面臨的重要產(chǎn)業(yè)和技術(shù)問題。

藻—菌共生體系顧名思義為藻類和菌類之間通過協(xié)調(diào)作用達(dá)到凈化水體目的的一種共生技術(shù)體系。水中的有機(jī)污染物經(jīng)好氧型細(xì)菌氧化分解產(chǎn)生CO2和NH4+、PO4

3-等無機(jī)成分，能被藻類所吸收，且經(jīng)葉綠素的光合作用合成自身細(xì)胞物質(zhì)，并釋放O2供細(xì)菌繼續(xù)氧化有機(jī)物之用。目前，藻菌共生技術(shù)中常用的微藻主要有螺旋藻、小球藻、銅綠微囊藻、衣藻、月牙藻、柵藻、短帶鞘藻、念珠藻、褐胞藻等，而常用的菌類有硝化細(xì)菌、芽孢桿菌、曲霉菌、黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉等。盡管如此，小球藻和米曲霉共生體系在養(yǎng)殖水體脫氮除磷方面的應(yīng)用還相對較少。為此，本研究通過制備小球藻與米曲霉的共生體系，分析該共生體系對水中氨氮、亞硝酸鹽氮的去除能力，以期為池塘養(yǎng)殖水體的凈化和修復(fù)處理提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 小球藻和米曲霉培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用普通小球藻（Chlorellavulgaris）和米曲霉（Aspergillusoryzae）均由中南大學(xué)環(huán)境與水資源研究中心提供。BG11為培養(yǎng)基，小球藻于26℃、光照強(qiáng)度4,000lx、12L∶12D條件下批量培養(yǎng)，待其生長至對數(shù)期，4,000rpm離心5min，去上清，收集藻細(xì)胞。米曲霉的培養(yǎng)方法，即將米曲霉孢子接種于pH值7.0的改良馬丁固體培養(yǎng)基后，置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)3～5d，待其長出黃綠色孢子后，將菌種置于改良馬丁固體培養(yǎng)基中并4℃保存，備用。

圖1 不同小球藻密度條件下形成的藻菌共生小球

1.2 共生小球的構(gòu)建

將米曲霉孢子接種于盛有無菌改良馬丁液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，輕搖1min，封口，置于28℃的恒溫振蕩器中，160r/min震蕩培養(yǎng)48h，形成穩(wěn)定的白色真菌小球。將 350個(gè)左右真菌小球用滅菌的生理鹽水沖洗2～3次后分別置于細(xì)胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中，置于26 ℃的恒溫振蕩器中、光照強(qiáng)度1,800lx、160r/min，12L∶12D條件下培養(yǎng)與小球藻共同培養(yǎng)，制備藻菌共生小球。每個(gè)處理組重復(fù)3次。培養(yǎng)24h后，輕輕混勻培養(yǎng)液，取少量培養(yǎng)液、0.45μm 針式過濾器過濾，分光光度計(jì)測定濾液吸光度，以確定培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度，從而評價(jià)米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭省?/p>

1.3 共生小球的脫氮效能

取350個(gè)真菌小球放入250mL錐形瓶中與小球藻共同培養(yǎng)，小球藻密度為8.75×106（固定率最優(yōu)組）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，形成穩(wěn)定的藻-菌共生小球體系備用。在該共生體系中添加氯化銨和亞硝酸鈉使氨氮（NH3-N）和亞硝酸鹽氮（NO2--N）終濃度分別達(dá)到2.0mg/L和1.0mg/L。重復(fù)4次。分別于共同培養(yǎng)后1、3、6、9、12、24、48h后取少量培養(yǎng)液，用0.45μm針式過濾器過濾后，采用德國CleverChem全自動化學(xué)分析儀測定其NH3-N和NO2-N含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖2 米曲霉小球?qū)Σ煌芏刃∏蛟宓墓潭?

圖3 藻菌共生小球?qū)H3-N和NO2-N的去除情況

米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭?（初始藻細(xì)胞密度-取樣時(shí)藻細(xì)胞密度）/初始藻細(xì)胞密度。分別采用Excel2016和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，Origin9.0軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 藻菌共生小球的制備與優(yōu)化

圖1顯示，分別將350個(gè)米曲霉真菌小球放入藻細(xì)胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中，與小球藻混合震蕩培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中藻細(xì)胞會逐步附著在真菌小球表面，真菌小球由白色變成淺綠色。錐形瓶中的培養(yǎng)液顏色會隨著藻細(xì)胞被米曲霉小球固定由深綠色逐漸變淺，直至清澈透明，但不同藻細(xì)胞密度與真菌小球的結(jié)合情況不同，形成顏色深淺不同的共生小球。藻細(xì)胞密度為15×106、18×106、21×106cell/mL時(shí)真菌小球?qū)υ寮?xì)胞的固定效果相對較差，表現(xiàn)為培養(yǎng)液顏色呈現(xiàn)藻細(xì)胞的綠色。

以共生體系培養(yǎng)基中藻細(xì)胞初始密度為橫坐標(biāo)，米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭蕿榭v坐標(biāo)，擬合的細(xì)胞密度與固定率曲線呈現(xiàn)先上升后下降的整體趨勢 （圖2）。該曲線的回歸方程為y=-4×10-13x2+7×10-6x+66.558（R2=0.908）。經(jīng)計(jì)算得知，藻細(xì)胞密度為8.75×106cell/mL時(shí)，米曲霉菌小球?qū)π∏蛟宓墓潭首罡摺?/p>

2.2 藻菌共生小球的脫氮效能

實(shí)驗(yàn)期間，對照組NH3-N含量總體保持穩(wěn)定，在初始值1.126mg/L基礎(chǔ)上輕微波動。藻菌共生小球組培養(yǎng)液中NH3-N含量隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，在9h時(shí)去除率達(dá)到了最大值99.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氨氮平均濃度為0.085mg/L（圖3）。對照組NO2-N含量總體保持穩(wěn)定，在初始值1.114mg/L基礎(chǔ)上輕微波動。實(shí)驗(yàn)開始12h后，藻菌共生小球組培養(yǎng)液中NO2-N去除率達(dá)到最大值 99.8% （圖3）。

3 討論

藻菌共生體系是通過藻類和菌類之間協(xié)調(diào)作用而達(dá)到凈化水體的一種生物處理技術(shù)體系。水體中的有機(jī)污染物，經(jīng)藻菌共生體系中好氧型細(xì)菌氧化分解產(chǎn)生CO2和 NH4+、PO43-等營養(yǎng)鹽，藻類吸收這些營養(yǎng)鹽并通過葉綠素的光合作用合成自身細(xì)胞物質(zhì)，釋放 O2供細(xì)菌繼續(xù)氧化有機(jī)物之用。因此，藻菌共生技術(shù)因具有效果好、周期短、二次污染小、成本低和易回收等優(yōu)點(diǎn)而展示廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用小球藻和米曲霉來制備藻菌共生體系，發(fā)現(xiàn)將小球藻細(xì)胞密度從3×106cell/mL 開始升高到21×106cell/mL，米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭孰S著藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)先增后降的趨勢，經(jīng)方程擬合計(jì)算，密度為8.75×106cell/mL 時(shí)米曲霉小球?qū)π∏蛟寮?xì)胞的固定效率最佳，這為下一步利用藻菌共生小球?qū)λw進(jìn)行脫氮處理研究與實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

養(yǎng)殖水體中含有大量的氮、磷營養(yǎng)鹽，高濃度的氨氮和亞硝酸鹽不但能損害養(yǎng)殖對象的組織結(jié)構(gòu)、生理特征和代謝能力，導(dǎo)致養(yǎng)殖對象的大量死亡，也能對漁業(yè)環(huán)境造成影響。因此，氨氮和亞硝酸鹽氮也是養(yǎng)殖尾水排放重點(diǎn)監(jiān)控指標(biāo)。大量研究顯示，藻菌共生體系可以有效地去除養(yǎng)殖水體中的氮磷營養(yǎng)鹽。共生體系中地衣芽孢桿菌、硝化細(xì)菌、月芽藻、四尾柵藻比例為1∶2∶2∶2時(shí)，對養(yǎng)殖廢水 NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TP 的去除效果最佳，去除率分別達(dá)到89.16%、100%、98.62%和100%。小球藻和芽孢桿菌共生系統(tǒng)對海水養(yǎng)殖尾水的中NH4+-N、PO43+-P、TP和CODMn的去除率分別為 96.57%、98.62%、89.89% 和 39.09%。本研究制備的米曲霉和小球藻共生小球能夠有效的去除水中NH3-N和 NO2-N，且在12h內(nèi)去除率幾乎接近100%（圖3），進(jìn)一步證實(shí)通過合適的藻菌共生體系，可以有效地消除養(yǎng)殖水體氮營養(yǎng)鹽。本研究構(gòu)建的小球藻和米曲霉共生小球具有起效速度快，去除效率高等優(yōu)點(diǎn)，在水體凈化處理方面具有較大的應(yīng)用潛力。盡管如此，該藻菌共生系統(tǒng)在養(yǎng)殖尾水處理的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面，仍面臨諸多問題，如共生小球在養(yǎng)殖水體中的去除效率、共生小球固定載體的選擇、載體的固定效率和共生小球的回收等均有待于進(jìn)一步地深入研究與試驗(yàn)，而這些也是未來藻菌共生技術(shù)的研究方向。（參考文獻(xiàn)略）