■李科靜 周詩琪 聶凌云 葛燕婷 余建波 李德亮
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128)
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要組成部分,在提供優(yōu)質(zhì)動物蛋白和改善居民膳食結(jié)構(gòu)方面做出了突出的貢獻(xiàn)。2019年,全年水產(chǎn)品產(chǎn)量6,450萬t,其中養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量5,050萬t,養(yǎng)殖產(chǎn)量連續(xù)30年穩(wěn)居世界第一(2019年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào))。近年來,隨著產(chǎn)業(yè)集約化和規(guī)?;潭鹊牟粩嘣鰪?qiáng),水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對水域環(huán)境的潛在威脅日益受到政府和社會的高度關(guān)注。氨氮和亞硝酸鹽氮不僅是養(yǎng)殖尾水排放監(jiān)管的兩大重要指標(biāo),而且高濃度的氨氮和亞硝酸鹽能損害養(yǎng)殖對象的組織結(jié)構(gòu)、生理特征和代謝能力,從而導(dǎo)致大量死亡。隨著國家水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水污染物排放相關(guān)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的相繼出臺,養(yǎng)殖水體的綜合治理與修復(fù)將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)日常管理的重要內(nèi)容之一,研發(fā)養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽原位修復(fù)技術(shù)和養(yǎng)殖尾水異位凈化技術(shù)也必將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所面臨的重要產(chǎn)業(yè)和技術(shù)問題。
藻—菌共生體系顧名思義為藻類和菌類之間通過協(xié)調(diào)作用達(dá)到凈化水體目的的一種共生技術(shù)體系。水中的有機(jī)污染物經(jīng)好氧型細(xì)菌氧化分解產(chǎn)生CO2和NH4+、PO4
3-等無機(jī)成分,能被藻類所吸收,且經(jīng)葉綠素的光合作用合成自身細(xì)胞物質(zhì),并釋放O2供細(xì)菌繼續(xù)氧化有機(jī)物之用。目前,藻菌共生技術(shù)中常用的微藻主要有螺旋藻、小球藻、銅綠微囊藻、衣藻、月牙藻、柵藻、短帶鞘藻、念珠藻、褐胞藻等,而常用的菌類有硝化細(xì)菌、芽孢桿菌、曲霉菌、黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉等。盡管如此,小球藻和米曲霉共生體系在養(yǎng)殖水體脫氮除磷方面的應(yīng)用還相對較少。為此,本研究通過制備小球藻與米曲霉的共生體系,分析該共生體系對水中氨氮、亞硝酸鹽氮的去除能力,以期為池塘養(yǎng)殖水體的凈化和修復(fù)處理提供技術(shù)參考。
實(shí)驗(yàn)用普通小球藻(Chlorellavulgaris)和米曲霉(Aspergillusoryzae)均由中南大學(xué)環(huán)境與水資源研究中心提供。BG11為培養(yǎng)基,小球藻于26℃、光照強(qiáng)度4,000lx、12L∶12D條件下批量培養(yǎng),待其生長至對數(shù)期,4,000rpm離心5min,去上清,收集藻細(xì)胞。米曲霉的培養(yǎng)方法,即將米曲霉孢子接種于pH值7.0的改良馬丁固體培養(yǎng)基后,置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)3~5d,待其長出黃綠色孢子后,將菌種置于改良馬丁固體培養(yǎng)基中并4℃保存,備用。
圖1 不同小球藻密度條件下形成的藻菌共生小球
將米曲霉孢子接種于盛有無菌改良馬丁液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中,輕搖1min,封口,置于28℃的恒溫振蕩器中,160r/min震蕩培養(yǎng)48h,形成穩(wěn)定的白色真菌小球。將 350個(gè)左右真菌小球用滅菌的生理鹽水沖洗2~3次后分別置于細(xì)胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中,置于26 ℃的恒溫振蕩器中、光照強(qiáng)度1,800lx、160r/min,12L∶12D條件下培養(yǎng)與小球藻共同培養(yǎng),制備藻菌共生小球。每個(gè)處理組重復(fù)3次。培養(yǎng)24h后,輕輕混勻培養(yǎng)液,取少量培養(yǎng)液、0.45μm 針式過濾器過濾,分光光度計(jì)測定濾液吸光度,以確定培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度,從而評價(jià)米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭省?/p>
取350個(gè)真菌小球放入250mL錐形瓶中與小球藻共同培養(yǎng),小球藻密度為8.75×106(固定率最優(yōu)組)的培養(yǎng)液中培養(yǎng),形成穩(wěn)定的藻-菌共生小球體系備用。在該共生體系中添加氯化銨和亞硝酸鈉使氨氮(NH3-N)和亞硝酸鹽氮(NO2--N)終濃度分別達(dá)到2.0mg/L和1.0mg/L。重復(fù)4次。分別于共同培養(yǎng)后1、3、6、9、12、24、48h后取少量培養(yǎng)液,用0.45μm針式過濾器過濾后,采用德國CleverChem全自動化學(xué)分析儀測定其NH3-N和NO2-N含量。
圖2 米曲霉小球?qū)Σ煌芏刃∏蛟宓墓潭?
圖3 藻菌共生小球?qū)H3-N和NO2-N的去除情況
米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭?(初始藻細(xì)胞密度-取樣時(shí)藻細(xì)胞密度)/初始藻細(xì)胞密度。分別采用Excel2016和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,Origin9.0軟件制圖。
圖1顯示,分別將350個(gè)米曲霉真菌小球放入藻細(xì)胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中,與小球藻混合震蕩培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液中藻細(xì)胞會逐步附著在真菌小球表面,真菌小球由白色變成淺綠色。錐形瓶中的培養(yǎng)液顏色會隨著藻細(xì)胞被米曲霉小球固定由深綠色逐漸變淺,直至清澈透明,但不同藻細(xì)胞密度與真菌小球的結(jié)合情況不同,形成顏色深淺不同的共生小球。藻細(xì)胞密度為15×106、18×106、21×106cell/mL時(shí)真菌小球?qū)υ寮?xì)胞的固定效果相對較差,表現(xiàn)為培養(yǎng)液顏色呈現(xiàn)藻細(xì)胞的綠色。
以共生體系培養(yǎng)基中藻細(xì)胞初始密度為橫坐標(biāo),米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭蕿榭v坐標(biāo),擬合的細(xì)胞密度與固定率曲線呈現(xiàn)先上升后下降的整體趨勢 (圖2)。該曲線的回歸方程為y=-4×10-13x2+7×10-6x+66.558(R2=0.908)。經(jīng)計(jì)算得知,藻細(xì)胞密度為8.75×106cell/mL時(shí),米曲霉菌小球?qū)π∏蛟宓墓潭首罡摺?/p>
實(shí)驗(yàn)期間,對照組NH3-N含量總體保持穩(wěn)定,在初始值1.126mg/L基礎(chǔ)上輕微波動。藻菌共生小球組培養(yǎng)液中NH3-N含量隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長呈現(xiàn)顯著的下降趨勢,在9h時(shí)去除率達(dá)到了最大值99.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氨氮平均濃度為0.085mg/L(圖3)。對照組NO2-N含量總體保持穩(wěn)定,在初始值1.114mg/L基礎(chǔ)上輕微波動。實(shí)驗(yàn)開始12h后,藻菌共生小球組培養(yǎng)液中NO2-N去除率達(dá)到最大值 99.8% (圖3)。
藻菌共生體系是通過藻類和菌類之間協(xié)調(diào)作用而達(dá)到凈化水體的一種生物處理技術(shù)體系。水體中的有機(jī)污染物,經(jīng)藻菌共生體系中好氧型細(xì)菌氧化分解產(chǎn)生CO2和 NH4+、PO43-等營養(yǎng)鹽,藻類吸收這些營養(yǎng)鹽并通過葉綠素的光合作用合成自身細(xì)胞物質(zhì),釋放 O2供細(xì)菌繼續(xù)氧化有機(jī)物之用。因此,藻菌共生技術(shù)因具有效果好、周期短、二次污染小、成本低和易回收等優(yōu)點(diǎn)而展示廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用小球藻和米曲霉來制備藻菌共生體系,發(fā)現(xiàn)將小球藻細(xì)胞密度從3×106cell/mL 開始升高到21×106cell/mL,米曲霉小球?qū)π∏蛟宓墓潭孰S著藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)先增后降的趨勢,經(jīng)方程擬合計(jì)算,密度為8.75×106cell/mL 時(shí)米曲霉小球?qū)π∏蛟寮?xì)胞的固定效率最佳,這為下一步利用藻菌共生小球?qū)λw進(jìn)行脫氮處理研究與實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。
養(yǎng)殖水體中含有大量的氮、磷營養(yǎng)鹽,高濃度的氨氮和亞硝酸鹽不但能損害養(yǎng)殖對象的組織結(jié)構(gòu)、生理特征和代謝能力,導(dǎo)致養(yǎng)殖對象的大量死亡,也能對漁業(yè)環(huán)境造成影響。因此,氨氮和亞硝酸鹽氮也是養(yǎng)殖尾水排放重點(diǎn)監(jiān)控指標(biāo)。大量研究顯示,藻菌共生體系可以有效地去除養(yǎng)殖水體中的氮磷營養(yǎng)鹽。共生體系中地衣芽孢桿菌、硝化細(xì)菌、月芽藻、四尾柵藻比例為1∶2∶2∶2時(shí),對養(yǎng)殖廢水 NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TP 的去除效果最佳,去除率分別達(dá)到89.16%、100%、98.62%和100%。小球藻和芽孢桿菌共生系統(tǒng)對海水養(yǎng)殖尾水的中NH4+-N、PO43+-P、TP和CODMn的去除率分別為 96.57%、98.62%、89.89% 和 39.09%。本研究制備的米曲霉和小球藻共生小球能夠有效的去除水中NH3-N和 NO2-N,且在12h內(nèi)去除率幾乎接近100%(圖3),進(jìn)一步證實(shí)通過合適的藻菌共生體系,可以有效地消除養(yǎng)殖水體氮營養(yǎng)鹽。本研究構(gòu)建的小球藻和米曲霉共生小球具有起效速度快,去除效率高等優(yōu)點(diǎn),在水體凈化處理方面具有較大的應(yīng)用潛力。盡管如此,該藻菌共生系統(tǒng)在養(yǎng)殖尾水處理的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面,仍面臨諸多問題,如共生小球在養(yǎng)殖水體中的去除效率、共生小球固定載體的選擇、載體的固定效率和共生小球的回收等均有待于進(jìn)一步地深入研究與試驗(yàn),而這些也是未來藻菌共生技術(shù)的研究方向。(參考文獻(xiàn)略)