多鱗鱚vhl基因克隆及其低氧脅迫下的表達變化

林星樺 潘炎楊 陳芳圓 黃志棚 黃洋 杜濤 朱春華 李廣麗 田昌緒

摘要：【目的】克隆多鱗鱚林島綜合征基因（vhl）并分析其在低氧脅迫下的表達變化，為揭示多鱗鱚應(yīng)對低氧的適應(yīng)機制提供研究資料，也為今后開展多鱗鱚新品種選育提供候選基因?！痉椒ā坎捎肞CR克隆多鱗鱚vhl基因cDNA全長序列，利用EditSeq、SMART、Signal IP 4.1及ClustalX等在線軟件進行生物信息學分析;并以半定量PCR檢測多鱗鱚vhl基因在不同組織中的表達情況，采用實時熒光定量PCR分析低氧脅迫對多鱗鱚vhl基因在鰓組織和心臟中表達的影響?！窘Y(jié)果】多鱗鱚vhl基因cDNA序列全長727 bp，包括120 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-TUR）、106 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-TUR）和504 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼167個氨基酸殘基，編碼蛋白存在4個結(jié)構(gòu)域，即Pfam：VHL（第12～93位氨基酸）、Pfam：VHL_C（第5～22、31～39和98～153位氨基酸）、ParB結(jié)構(gòu)域（第100～162位氨基酸）和SOCS_box結(jié)構(gòu)域（第104～140位氨基酸）。多鱗鱚vhl氨基酸序列與盲曹魚vhl氨基酸序列的同源性最高（81%），但系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果顯示多鱗鱚與攀鱸的親緣關(guān)系最近。多鱗鱚vhl基因在不同組織中均有表達，其中以鰓組織、卵巢和精巢的表達量較高，其次是心臟和肝臟，在肌肉和腦組織的表達量較低。經(jīng)低氧脅迫后，多鱗鱚vhl基因在鰓組織中的相對表達量顯著上調(diào)（P<0.05，下同）;在心臟中表現(xiàn)為隨低氧脅迫時間的延長顯著上調(diào)，恢復(fù)氧氣4 h后vhl基因的相對表達量雖然呈顯著下調(diào)趨勢，但仍顯著高于正常水平?！窘Y(jié)論】多鱗鱚vhl基因編碼蛋白存在Pfam：VHL、Pfam：VHL_C、ParB和SOCS_box等4個結(jié)構(gòu)域，且低氧脅迫前后其表達量存在顯著差異，即多鱗鱚vhl基因在低氧應(yīng)答信號通路中扮演著重要角色。

關(guān)鍵詞： 多鱗鱚;vhl基因;低氧脅迫;表達變化

中圖分類號： S965.399? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1201-08

Abstract：【Objective】The Von Hippel-Lindau syndrome gene（vhl） of the Sillago sihama was cloned and its expression changes after hypoxia stress treatment were analyzed， which represented the insights into the underlying adaptation mechanisms of hypoxia stress and provided candidate genes for breed selection of S. sihama. 【Method】cDNA sequence of vhl gene from S. sihama was cloned by PCR. Bioinformatics analysis on the sequence was conducted by online softwares such as EditSeq，SMART， Signal IP 4.1 and ClustalX， expression of vhl gene in different tissues were detected by semiquantitative PCR， and effects of hypoxia stress on expression of vhl gene in gill and heart tissues were studied by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The vhl cDNA sequence was 727 bp in length， including a 5'-end noncoding region of 120 bp， a 3'-end noncoding region of 106 bp and an open reading frame（ORF） of 504 bp encoding a polypeptide of 167 amino acids.Four domains of the vhl protein were found， namely Pfam：VHL amino acids 12 to 93， Pfam：VHL_C （amino acids 5 to 22， 31 to 39 and 98 to 153）， and ParB domain（amino acid 100 to 162） and SOCS_box domain （amino acids 104 to 140）. Multi-sequence alignment analysis of the S. sihama vhl gene showed the highest（81%） homology with Lates calcarifer. Cluster analysis showed that the relationship between S. sihama and Anabas testudineus was the closest. vhl gene expressed in different tissues of S. sihama. Its expression in the gill was significantly up-regulated after hypoxia stress（P<0.05， the same below），? the expression of vhl gene in heart significantly up-regulated as hypoxia stress prolonged， and significantly down-regulated 4 h after reoxygen treatment， bur is was still significantly higher than normal level. 【Conclusion】There are four domains in vhl gene encoded protein of S. sihama， namely Pfam：VHL， Pfam： VHL_C， ParB and SOCS_box. The expression of vhl gene before and after hypoxia stress is significantly different， indicating that vhl gene plays an important role in the hypoxia response pathway in S. sihama.

Key words： Sillago sihama; vhl gene; hypoxia stress; expression variation

Foundation item： Scientific Research Project of Guangdong（2015A020209163）; College Featured Innovation Pro-ject of Guangdong（2019KTSCX060）; College Students Innovation and Entrepreneurship Project of Guangdong（CXXL 2018048， CXXL2019138）

0 引言

【研究意義】缺氧會影響魚類的生長、繁殖及行為活動，是影響大多數(shù)動物有氧代謝與存活的重要環(huán)境因素，已成為阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的限制性因子（Pollock et al.，2007;Roberts et al.，2011;武曉會等，2018）。低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）介導(dǎo)的低氧信號通路是細胞產(chǎn)生低氧應(yīng)答的核心信號通路之一（李福祥等，2004;Dunwoo-die，2009;肖武漢，2014）。在低氧信號通路中，林島綜合征基因（Von hippel-lindau tumor suppressor，vhl）發(fā)揮著重要作用，其介導(dǎo)HIF-1α的表達調(diào)控，以確保生物體能及時啟動低氧應(yīng)答。在常氧條件下，vhl基因介導(dǎo)HIF-1α降解，而抑制其下游基因表達;但在低氧條件下，vhl無法利用氧分子使HIF-1α降解，進而引發(fā)一系列低氧應(yīng)答反應(yīng)（Dunwoodie，2009;肖武漢，2014）。因此，加強vhl基因研究對揭示動物機體的低氧適應(yīng)機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明，在體細胞中腫瘤抑制因子pVHL能與Elongin B和Elongin C結(jié)合形成VBC泛素連接酶復(fù)合體而具有E3泛素酶蛋白活性，促使羥基化的HIF-1α泛素化并降解（肖武漢，2014）。在常氧條件下，vhl與脯氨酸羥化酶（Prolyl hydroxylase，PHD）結(jié)合利用氧氣中的氧分子使HIF-1α羥基化、泛素化并降解，限制HIF-1α與HIF-1β結(jié)合，從而抑制其下游基因的表達;而在低氧條件下，由于氧氣含量下降，vhl無法利用氧分子使HIF-1α降解，HIF-1α與HIF-1β正常結(jié)合，激活血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）等下游基因表達（Kaelin，2007），引起紅細胞增加、血管擴張等低氧應(yīng)答反應(yīng)。在小鼠肝臟星狀細胞中，vhl蛋白水平下降導(dǎo)致HIF-1α積累并激活VEGF表達，參與肝臟血管生成（Ankoma-Sey et al.，2000;Corpechot et al.，2002;Wang et al.，2004）;在小鼠腎間質(zhì)細胞中，vhl蛋白缺失可導(dǎo)致腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)中EPO大量表達（Broeker et al.，2020）。在人類透明細胞腎細胞癌變細胞中，vhl蛋白失活后HIF激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（Glucose transporter type 1，GLUT1）調(diào)節(jié)葡萄糖攝取，并調(diào)控多種糖酵解酶和乳酸脫氫酶的表達，以增加糖酵解通量（Semenza et al.，1994;Chakraborty，2020）。在斑馬魚（Danio rerio）（van Rooijen et al.，2009）、瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）（Zhang et al.，2017）和暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）（Li et al.，2019）等水產(chǎn)物種中進行低氧脅迫處理后，均可促使其vhl基因mRNA表達水平顯著上升，表明vhl基因在魚類低氧脅迫轉(zhuǎn)錄響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，但其對低氧脅迫的響應(yīng)機制尚未明確?！颈狙芯壳腥朦c】多鱗鱚（Sillago sihama）又名沙錐魚，隸屬于鱸形目（Perciformes）鱚科（Sillaginidae）鱚屬（Sillago），主要分布于印度洋—西太平洋熱帶淺海，是一種廣溫、廣鹽性魚類（薛泰強，2010;黃洋等，2013）。多鱗鱚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，深受消費者喜愛，是我國重要的經(jīng)濟魚類之一（杜濤和黃洋，2009）。近年來由于過度捕撈，導(dǎo)致多鱗鱚種群數(shù)量銳減，產(chǎn)量降低，而急需通過人工養(yǎng)殖增加產(chǎn)量以滿足市場需求。但多鱗鱚耐低氧能力差（窒息點約1.0 mg/L）、應(yīng)激反應(yīng)強（杜濤等，2009），難以實現(xiàn)大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖，嚴重制約其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。因此，亟待開展多鱗鱚vhl基因的相關(guān)研究以明確其低氧響應(yīng)分子機制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆多鱗鱚vhl基因cDNA全長，并分析vhl基因在多鱗鱚主要組織及低氧脅迫后鰓組織和心臟中的表達情況，為揭示多鱗鱚應(yīng)對低氧的適應(yīng)機制提供研究資料，也為今后開展多鱗鱚新品種選育提供候選基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試多鱗鱚由廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地提供。Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司，Power Green qPCR Mix（with ROX）購自廣州東盛生物科技有限公司。

1. 2 低氧脅迫處理

對多鱗鱚群體進行低氧脅迫預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)同一群體中不同多鱗鱚個體間耐低氧能力存在一定差異，平均窒息點約1.0 mg/L，出現(xiàn)大量浮頭現(xiàn)象時的溶解氧（DO）約1.3 mg/L。因此，正式試驗的低氧脅迫DO設(shè)為1.3 mg/L。將480尾體型相近的1齡多鱗鱚隨機分配到4個200 L水缸中（編號分別為1、2、3和4），每缸120尾，暫養(yǎng)1周后進行低氧脅迫處理。通過調(diào)節(jié)氮氣和空氣的充氣速度而控制養(yǎng)殖水體DO水平，實時監(jiān)測DO以符合試驗需求。試驗開始前測得每缸水體DO為8.0 mg/L，分別向1、2和3號缸水體持續(xù)通入氮氣使其DO降至1.3 mg/L，低氧處理（1.3 mg/L）1 h后，取1號缸10尾浮頭的多鱗鱚個體作為低氧脅迫1 h組（Hypoxia-1-h）;低氧處理（1.3 mg/L）6 h后，取2號缸10尾正?；顒拥亩圜[鱚個體作為低氧脅迫6 h組（Hypoxia-6-h）;低氧處理6 h后再通入氧氣使3號缸水體DO恢復(fù)至8.0 mg/L維持4 h后，取3號缸10尾正?；顒拥亩圜[鱚個體作為恢復(fù)氧氣組（Reoxygen-4-h）;4號缸持續(xù)通入空氣維持水體DO在8.0 mg/L，取出4號缸10尾正?；顒拥亩圜[鱚個體作為對照組（CK）。采樣前對魚進行麻醉，采集對照組多鱗鱚的鰓組織、心臟、肝臟、肌肉、腦組織、卵巢和精巢等7個組織，以及Hypoxia-1-h組、Hypoxia-6-h組和Reoxygen-4-h組多鱗鱚的心臟和鰓組織，每組均采集3尾。采集樣品經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

通過TRIzol法提取總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性;參照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 目的基因克隆

根據(jù)多鱗鱚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取vhl基因序列（Tian et al.，2019），采用Primer Premier 6.0設(shè)計擴增引物（表1）。以對照組多鱗鱚的心臟、肝臟、腦組織和鰓組織混合cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系25.0 μL：2×PCR Mix 12.5 μL，VHL-SS-ORF-F 1.0 μL，VHL-SS-ORF-R 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，雙蒸水8.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果，并挑選單一明亮的擴增條帶送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 5 生物信息學分析

使用EditSeq查找多鱗鱚vhl基因開放閱讀框（ORF）并翻譯成氨基酸序列，采用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測多鱗鱚vhl蛋白結(jié)構(gòu)域，以Signal IP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測多鱗鱚vhl蛋白前體信號肽，利用ClustalX比對多鱗鱚vhl氨基酸序列與其他脊椎動物的vhl氨基酸序列，并以MAGA 10.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 多鱗鱚vhl基因組織半定量分析

以多鱗鱚的心臟、鰓組織、肝臟、腦組織、精巢、卵巢和肌肉共7個組織cDNA為模板，以VHL-SS-RT-F和VHL-SS-RT-R（表1）為引物、β-actin基因為內(nèi)參基因，進行半定量PCR擴增。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增結(jié)果，并根據(jù)條帶亮度判斷多鱗鱚vhl基因表達量。

1. 7 低氧脅迫后多鱗鱚vhl基因表達定量分析

將不同低氧脅迫組及CK組的多鱗鱚心臟和鰓組織cDNA進行5倍稀釋，以VHL-SS-RT-F和VHL-SS-RT-R（表1）為引物、β-actin基因為內(nèi)參基因，使用LightCycler 96實時熒光定量分析儀（Roche，USA）進行定量分析。反應(yīng)體系20.0 μL：Power Green qPCR Mix（with ROX）10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，雙蒸水6.4 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個生物學重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，并通過SPSS 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 多鱗鱚vhl基因cDNA序列克隆及其序列分析結(jié)果

克隆獲得的多鱗鱚vhl基因cDNA序列全長727 bp（GenBank登錄號MN013394），包括120 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-TUR）、106 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-TUR）和504 bp的ORF，共編碼167個氨基酸殘基（圖1）。多鱗鱚vhl基因編碼蛋白主要有2個結(jié)構(gòu)域，即Pfam：VHL（第12～93位氨基酸）和Pfam：VHL_C（第5～22、31～39和98～153位氨基酸），還包括ParB結(jié)構(gòu)域（第100～162位氨基酸）和SOCS_box結(jié)構(gòu)域（第104～140位氨基酸）。據(jù)Signal IP 4.1預(yù)測結(jié)果顯示，多鱗鱚vhl蛋白無前體信號肽。

2. 2 多鱗鱚vhl氨基酸序列比對分析結(jié)果

vhl氨基酸序列BLASTp比對分析結(jié)果顯示，多鱗鱚vhl氨基酸序列與盲曹魚（Lates calcarifer）vhl氨基酸序列的同源性最高（81%），與高體鰤（Seriola dumerili）、攀鱸（Anabas testudineus）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的vhl氨基酸序列同源性較高（73%～78%），與爬行類、兩棲類和哺乳類等高級脊椎動物的同源性為52%～54%（表2和圖2）。從基于vhl氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）也可看出，所有魚類聚為一支，而爬行類、兩棲類和哺乳類聚為一支。其中，多鱗鱚與鱸形目的高體鰤、盲曹魚、尼羅羅非魚和攀鱸先聚為一小分支，且與攀鱸的親緣關(guān)系最近，與尼羅羅非魚、攀鱸和高體鰤的親緣關(guān)系次之，與斑點雀鱔（Lepisosteus oculatus）、斑馬魚（Danio rerio）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等魚類的親緣關(guān)系相對較遠。

2. 3 多鱗鱚vhl基因在不同組織中的表達情況

利用半定量PCR擴增檢測多鱗鱚vhl基因在鰓組織、心臟、腦組織、肝臟、卵巢、精巢和肌肉等7個組織中的表達情況，結(jié)果（圖4）顯示，多鱗鱚vhl基因在不同組織中均有表達，其中以鰓組織、卵巢和精巢的表達量較高，其次是心臟和肝臟，在肌肉和腦組織的表達量較低。

2. 4 低氧脅迫對多鱗鱚vhl基因在鰓組織和心臟中表達的影響

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，與CK組相比，Hypoxia-1-h組、Hypoxia-6-h組和Reoxygen-4-h組多鱗鱚vhl基因在鰓組織中的相對表達量顯著上調(diào)（P<0.05，下同），但各低氧脅迫處理組間的vhl基因相對表達量無顯著差異（P>0.05）。在心臟中，Hypoxia-1-h組和Hypoxia-6-h組多鱗鱚vhl基因的相對表達量較CK組均顯著上調(diào);Reoxygen-4-h組多鱗鱚vhl基因的相對表達量雖然較Hypoxia-6-h組顯著下調(diào)，但仍顯著高于CK組水平。

3 討論

HIF介導(dǎo)的低氧信號通路是細胞產(chǎn)生低氧應(yīng)答的核心信號通路之一（李福祥等，2004;Dunwoodie，2009;肖武漢，2014），而vhl在低氧信號通路中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于vhl基因的研究集中在哺乳類動物中，針對魚類的研究較少。本研究成功克隆獲得多鱗鱚vhl基因cDNA序列全長727 bp，包括120 bp的5'-TUR、106 bp的3'-TUR和504 bp的ORF，共編碼167個氨基酸殘基。多鱗鱚vhl基因編碼蛋白有4個結(jié)構(gòu)域，分別是Pfam：VHL（第12～93位氨基酸）、Pfam：VHL_C（第5～22、31～39和98～153位氨基酸）、ParB（第100～162位氨基酸）和SOCS_box（第104～140位氨基酸）。其中，Pfam：VHL是由β-折疊組成的β-結(jié)構(gòu)域（第12～93位氨基酸）（Stebbins et al.，1999）;Pfam：VHL_C是由2個連接體（第5～22和31～39位氨基酸）和1個極性接口（第98～153位氨基酸）組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域（Stebbins et al.，1999）;在哺乳動物Sulfiredoxin-1蛋白中含有ParB結(jié)構(gòu)域，而該蛋白有助于抗氧化應(yīng)激（Chang et al.，2004;Figge et al.，2010）;SOCS_box結(jié)構(gòu)域是特定底物與蛋白結(jié)合的位點（Bullock et al.，2007），如E3泛素蛋白連接酶。上述結(jié)構(gòu)域功能進一步證實vhl在低氧信號通路中發(fā)揮重要作用。多鱗鱚與其他脊椎動物的vhl氨基酸序列同源性比對分析結(jié)果表明，多鱗鱚與盲曹魚的同源性最高，為81%，與鱸形目其他魚類的同源性為73%～78%，與其他硬骨魚類的同源性為60%～67%，與爬行類、兩棲類和哺乳類的同源性較低（52%～54%）。系統(tǒng)發(fā)育進化分析結(jié)果也顯示，多鱗鱚與鱸形目魚類聚為一支，即vhl的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系與分類學進化關(guān)系一致。

已有研究發(fā)現(xiàn)，vhl基因在瓦氏黃顙魚（Zhang et al.，2017）和暗紋東方鲀（Li et al.，2019）各組織中均有表達分布。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，vhl基因在多鱗鱚主要組織中均有表達。其中，多鱗鱚vhl基因在鰓組織、卵巢和精巢中高度表達，在肝臟和心臟中的表達量次之，而在肌肉和腦組織中的表達量較低。但vhl基因在暗紋東方鲀和瓦氏黃顙魚中均以肝臟和心臟的表達量較高，而在腦組織和鰓組織的表達量相對較低（Zhang et al.，2017;Li et al.，2019）。vhl基因在多鱗鱚各組織中的表達量與暗紋東方鲀和瓦氏黃顙魚存在差異，說明vhl基因表達可能具有物種特異性。

本研究對比分析低氧脅迫前后多鱗鱚vhl基因在鰓組織和心臟中的表達變化，結(jié)果顯示，低氧脅迫1 h后多鱗鱚vhl基因在鰓組織和心臟中的表達量均顯著上調(diào)，但在瓦氏黃顙魚和暗紋東方鲀腦組織及肝臟中的表達量無顯著差異（Zhang et al.，2017;Li et al.，2019），表明不同魚類對低氧產(chǎn)生應(yīng)答的時間也不同;低氧脅迫6 h后多鱗鱚vhl基因在心臟中的表達量持續(xù)顯著上升，在瓦氏黃顙魚和暗紋東方鲀肝臟及腦組織中也有相似的表達規(guī)律（Zhang et al.，2017;Li et al.，2019），表明vhl基因在不同魚類低氧脅迫轉(zhuǎn)錄響應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。低氧脅迫6 h后，多鱗鱚vhl基因在鰓組織中的表達量較低氧脅迫1 h時無顯著差異，在暗紋東方鲀肝臟中有相同的表達模式，但暗紋東方鲀在低氧脅迫8 h后vhl基因在肝臟中的表達極顯著上升（Li et al.，2019），可能是vhl基因在不同組織間對低氧脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的時間不同?；謴?fù)氧氣4 h后，多鱗鱚vhl基因在鰓組織中的表達量與低氧脅迫時無顯著變化，在心臟中的表達量較低氧脅迫6 h時顯著下調(diào)，但仍顯著高于正常水平。Zhang等（2017）在瓦氏黃顙魚肝臟中觀察到與多鱗鱚鰓組織相同的表達模式，Li等（2019）則在暗紋東方鲀腦組織和肝臟中觀察到與多鱗鱚心臟相同的表達模式，可能與魚體在低氧脅迫再恢復(fù)氧氣后不同組織所處應(yīng)激狀態(tài)或受損程度不一致有關(guān)。

鰓組織作為魚類感受低氧脅迫最直接的器官，會以最快速度減輕低氧脅迫對機體的影響;而心臟作為魚類生命活動的重要器官，是在保證組織損傷程度最小的前提下對低氧進行響應(yīng)。在本研究中，低氧脅迫下多鱗鱚vhl基因在鰓組織和心臟中的應(yīng)答速度及表達穩(wěn)定性存在一定差異。在鰓組織中，多鱗鱚vhl基因的表達應(yīng)答速度快，各低氧脅迫處理組與CK組間存在顯著差異，但各低氧脅迫處理組間的表達量穩(wěn)定，無顯著變化。鰓組織在急性低氧脅迫環(huán)境下表現(xiàn)出強烈的結(jié)構(gòu)改變，包括鰓小片腫脹、抬升及細胞排列發(fā)生紊亂等（狄治朝等，2018）;低氧脅迫再恢復(fù)氧氣后，鰓組織結(jié)構(gòu)雖然能得到一定程度的恢復(fù)（楊明等，2019），但恢復(fù)程度與能力可能存在物種差異。多鱗鱚在低氧脅迫下其鰓組織結(jié)構(gòu)可能已發(fā)生較嚴重損傷，即使恢復(fù)氧氣相關(guān)功能基因感知DO的響應(yīng)能力仍較弱，表現(xiàn)為各低氧脅迫處理組間vhl基因表達量較穩(wěn)定，無顯著差異。在心臟中，多鱗鱚vhl基因的表達應(yīng)答速度較鰓組織慢，各低氧脅迫處理組與CK組間也存在顯著差異。心臟應(yīng)答速度慢，可能是因為魚類的心臟耐低氧能力較強，能適應(yīng)極端的低氧條件（Marques et al.，2008）。隨著低氧脅迫時間的延長，vhl基因在心臟中的表達量持續(xù)升高，但恢復(fù)氧氣后其表達量下降，可能是心臟為提高機體攜氧能力而做出的應(yīng)激反應(yīng)。綜上所述，vhl基因在魚類低氧脅迫轉(zhuǎn)錄應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，且在不同物種不同組織間的表達存在差異，即vhl基因功能可能具有組織特異性和物種特異性，但具體原理有待進一步探究。

4 結(jié)論

多鱗鱚vhl基因編碼蛋白存在Pfam：VHL、Pfam：VHL_C、ParB和SOCS_box等4個結(jié)構(gòu)域，且低氧脅迫前后其表達量存在顯著差異，即多鱗鱚vhl基因在低氧應(yīng)答信號通路中扮演著重要角色。

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（責任編輯 蘭宗寶）