香蕉枯萎病拮抗菌GKT04產(chǎn)生的脂肽類抗生素的分離和鑒定

田丹丹 周維 李朝生 韋弟 覃柳燕 黃素梅 韋莉萍 龍盛風(fēng) 何章飛 韋紹龍

摘要：【目的】對香蕉枯萎病拮抗菌GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素進(jìn)行分離，分析其抑菌活性相關(guān)成分，為揭示菌株GKT04的抑菌機(jī)理及應(yīng)用該菌株防控香蕉枯萎病提供理論依據(jù)。【方法】以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amy-loliquefaciens）GKT04、香蕉枯萎病菌4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)OC4）和桂蕉1號為試驗(yàn)材料，利用特異性引物對菌株GKT04中ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC脂肽類抗生素合成相關(guān)基因進(jìn)行檢測;利用鹽酸沉淀、甲醇抽提等步驟得到菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素，利用高效液相色譜（HPLC）對脂肽類抗生素進(jìn)行分離，對收集的洗脫峰組分進(jìn)行體外抑制致病菌FOC4效果試驗(yàn)，對抑菌活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析?！窘Y(jié)果】菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑菌圈直徑為24 mm，盆栽防控效果與對照相比病情指數(shù)降低了78.31%;PCR擴(kuò)增顯示菌株GKT04含有ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB基因，而ituB、sfp和bmyC未擴(kuò)增出;菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物經(jīng)HPLC分離后共收集到4個組分P1、P2、P3和P4，其中組分P1和組分P3對致病菌FOC4的抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為18和15 mm;經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，組分P1和組分P3分別為脂肽類抗生素fengycins和bacillomycin D?！窘Y(jié)論】解淀粉芽孢桿菌GKT04產(chǎn)生fengycins和bacillomycin D兩類脂肽類抗生素。

關(guān)鍵詞： 香蕉枯萎病;解淀粉芽孢桿菌GKT04;脂肽類抗生素;分離;鑒定

中圖分類號： S668.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1122-06

Abstract：【Objective】The lipopeptide antibiotics were isolated from the supernatant of fermented broth of Bacillus amyloliquefaciens GKT04 antagonistic to banana fusarium wilt， analysis of the antifungal activity was conducted for theoretical foundation for revealing the bacteriostasis mechanism of strain GKT04 and control of banana fusarium wilt with strain GKT04. 【Method】B. amyloliquefaciens GKT04， Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（FOC4） and Guijiao No.1 were used as materials. Eleven primers designed based on the known lipopeptides genes ituA， ituB， ituC， ituD， fenA， fenB， sfp， srfA， bmyA， bmyB and bmyC were used to amplify the corresponding genes from the genome of GKT04 strain. The crude lipopeptides extracts were extracted by acid precipitation and methanol from strain GKT04 fermentation supernatant， the extract was separated by high performance liquid chromatography（HPLC）， and antifungal activity test in vitro on FOC4 of the elution peak components collected was carried out. The components with antimicrobial activity were identified by matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS） techniques. 【Result】The crude extract of strain GKT04s lipopetide antibiotics inhibited the growth of FOC4， and the diameter was 24 mm. Pot experiments indicated that the disease index of banana seedlings reduced by 78.31% compared with the control. PCR amplification test results showed that GKT04 strain was able to amplify the ituA， ituC， ituD， fenA， fenB， srfA， bmyA and bmyB synthesis genes， but failed to amplify the ituB， sfp and bmyC synthesis genes. Four components（P1， P2， P3 and P4） were collected by HPLC from GKT04 lipopeptide antibiotic crude extract， P1 and P3 exhibited better antimicrobial activity to pathogenic bacteria FOC4? with inhibition zone diameters of 18 and 15 mm respectively. P1 was lipopeptide antibiotic fengycins and P3 was lipopeptide antibiotic bacillomycin D detected by MALDI-TOF-MS analysis. 【Conclusion】The lipopeptide antibiotics produced by Bacillus amyloliquefaciens GKT04 are fengycins and bacillomycin D.

Key words：banana fusariumwilt; Bacillus amyloliquefaciens GKT04; lipopetide antibiotic; isolation; identification

Foundation item： National Key Research and Development Program（2017YFD0202105-04）; Guang-xi Natural Scien-ce Foundation for Youth（2017GXNSFBA198219）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA181180 28-3）;Guangxi Key Research and Development Project （Guike AB19245026）

0 引言

【研究意義】香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubeuse，F(xiàn)oc）侵染香蕉植株而導(dǎo)致植株維管束壞死的土傳真菌病害。利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制土傳真菌病害是目前研究的重點(diǎn)。研究表明，芽孢桿菌及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能有效抑制植物病原真菌的生長（王帥，2009;宋莉莎等，2019;張忠良等，2019），在植物病害的生物防治中具有重要作用。因此，對芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分類和鑒別，為了解其抑菌機(jī)理及利用其更好地對病害進(jìn)行生物防治均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脂肽類抗生素是芽孢桿菌非核糖體途徑合成的抑制病原真菌生長的主要抑菌物質(zhì)（Tsuge et al.，2001;Romero et al.，2007;Zeriouh et al.，2011），主要包括伊枯草素家簇iturins（iturin A、iturin B、iturin C、iturin D和iturin E;bacillomycin D、bacillomycin F和bacillomycin L;mycosubtilin）、泛革素家簇fengycins（fengycin A和fengycin B）、表面活性素家簇surfactins和一些結(jié)構(gòu)未知的環(huán)肽抗生素（Ongena and Jacques，2008）。iturins主要通過破壞真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜來抑制真菌生長，其中iturin A的應(yīng)用最廣泛。iturin A合成酶操縱子有4個開放性閱讀框，分別編碼催化酶ituA、ituB、ituC和ituD。fengycins對絲狀真菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，其抑菌機(jī)理與iturins相似。編碼fengycins合成的fen操縱子由fenA、fenB、fenC、fenD和fenE 5個基因組成。surfactins雖然對真菌的抗性較弱，但可增強(qiáng)生防菌的定殖和誘導(dǎo)植物抗性。Ongena等（2007）發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌S499分泌的surfactins和fengycins協(xié)同作用誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。surfactins合成酶由srfAA、srfAB、srfAC和srfAD 4個亞基組成，由srfA操縱子編碼。張榮勝等（2013）發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Lx-11產(chǎn)生的脂肽類抗生素為surfactin、fengycin和bacillomycin D。劉宇帥等（2018）利用基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析鑒定解淀粉芽孢桿菌TF28產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)fengycins對尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制活性。張學(xué)雯等（2019）利用高效液相色譜—電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析（HPLC-ESI-MS）法將解淀粉芽孢桿菌B10-6-1產(chǎn)生的脂肽類抗生素鑒定為C14bacillocnycin D和C15bacillocnycin D?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】菌株GKT04是從香蕉根部分離獲得的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌株及其發(fā)酵上清液對香蕉枯萎病菌4號生理小種（FOC4）具有較強(qiáng)的抑制活性（田丹丹等，2018），但其抑菌機(jī)理目前尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用特異性引物對菌株GKT04中ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC脂肽類抗生素合成相關(guān)基因進(jìn)行檢測;利用鹽酸沉淀、甲醇抽提等步驟得到菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素，利用高效液相色譜（HPLC）對脂肽類抗生素進(jìn)行分離，對收集的洗脫峰組分進(jìn)行體外抑制FOC4效果試驗(yàn)，并對抑菌活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測分析，從而實(shí)現(xiàn)對菌株GKT04產(chǎn)生的脂肽類抗生素進(jìn)行分離純化及鑒定，明確該菌株產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類，為揭示該菌株的抑菌機(jī)理及香蕉枯萎病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GKT04由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所香蕉遺傳改良研究室篩選并保藏;香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)OC4）由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所香蕉遺傳改良研究室分離并保藏;桂蕉1號（廣西香蕉常規(guī)主栽品種）由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 脂肽類抗生素粗提物的制備 將平板上的菌株GKT04用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有10 mL LB培養(yǎng)基的小瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)9～15 h。按1%的接種量再轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。4 ℃下6000 r/min離心20 min除去菌體。上清液中加入6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0～2.5，邊加鹽酸邊輕微攪拌，于4 ℃冰箱過夜，8000 r/min離心30 min，收集沉淀。沉淀干燥后向每管沉淀中加入0.5 mL pH 7.0的甲醇，混勻后萃取4～8 h，然后8000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液。同樣方法萃取2次，合并上清液用0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌的抑菌效果 用無菌水將致病菌FOC4的菌落洗脫，得到孢子液。用無菌水將孢子液稀釋至105 CFU/mL。按1%的接種量將FOC4孢子液混合到PDA培養(yǎng)基中倒平板。牛津杯插入平板中央，向牛津杯中加入200 μL脂肽類抗生素粗提物，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，觀察抑菌效果，測定抑菌圈直徑。每處理重復(fù)3次。

1. 2. 3 脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌的盆栽防控效果 用1.2.1的方法制備菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物。選取長勢一致的香蕉砂培幼苗（5～6片葉子）種植于營養(yǎng)杯中，采用灌根法接種菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物20 mL，以接種空白LB培養(yǎng)基為對照，7 d后傷根，淋孢子懸浮液濃度為5×106 CFU/mL的致病菌FOC4菌液20 mL。每處理10株，重復(fù)3次。50 d后調(diào)查植株發(fā)病情況。香蕉苗期枯萎病分級參考黃素梅等（2019）的方法。按以下公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=[∑（各級發(fā)病數(shù)×相對級數(shù)值）供試植株總數(shù)×最高病級]×100

防治效果（%）=（清水對照病情指數(shù)-處理病情

指數(shù)）/清水對照病情指數(shù)×100

1. 2. 4 合成脂肽類抗生素相關(guān)基因的克隆檢測

設(shè)計(jì)擴(kuò)增ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC基因的引物序列（表1），以菌株GKT04基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1. 2. 5 脂肽類抗生素的HPLC分離 利用Agilent HPLC-1100將脂肽類抗生素樣品注入C18柱（賽默飛色譜柱，4.6 mm×250 mm，0.5 mm），VWD紫外檢測器，流速1 mL/min，波長214 nm，流動相：乙腈（10 mmol/L）∶醋酸銨=3∶4（v/v）。收集各保留時間對應(yīng)的抗菌物質(zhì)組分，冷凍干燥后，1 mL甲醇溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將收集的各個組分按1.2.2的方法進(jìn)行抑菌活性檢測，活性較好的組分進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1. 2. 6 脂肽類抗生素的質(zhì)譜檢測分析 利用MALDI-TOF-MS對HPLC收集的有效組分進(jìn)行脂肽類抗生素種類檢測及鑒定分析（Koumoutsi et al.，2004）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 脂肽類粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑制效果

菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4具有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為24 mm（圖1）。

2. 2 脂肽類粗提物對香蕉枯萎病的盆栽防控效果

接種香蕉枯萎病致病菌FOC4 15 d后，對照組和處理組的部分植株開始出現(xiàn)葉片黃化的發(fā)病癥狀，接種致病菌50 d后，對照組的病情指數(shù)為72.14，處理組的病情指數(shù)為15.65，與對照組相比，處理組的香蕉枯萎病病情指數(shù)降低了78.31%。

2. 3 脂肽類抗生素合成相關(guān)基因的克隆結(jié)果

以菌株GKT04基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因，可擴(kuò)增出ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB基因，將上述基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，與已提交的解淀粉芽孢桿菌相關(guān)基因序列同源性均在98%以上;未擴(kuò)增出ituB、sfp和bmyC基因（圖2）。

2. 4 脂肽類抗生素的HPLC分離結(jié)果

菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類抗生素粗提物經(jīng)HPLC分離后共得到4個組分P1、P2、P3和P4，其中組分P1和組分P2不是單一的離子峰，說明這2個組分不是單一物質(zhì)，可能是結(jié)構(gòu)相似的同系物或異構(gòu)體（圖3）。

2. 5 各組分對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑菌效果

分別對上述4個組分進(jìn)行FOC4抑菌試驗(yàn)，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，除組分P2無抑菌效果外，其余組分對FOC4均具有抑菌效果，其中組分P1和組分P3的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑分別為18和15 mm，組分P4的抑菌效果較弱，抑菌圈直徑為11 mm。

2. 6 脂肽類抗生素種類的初步分析

利用MALDI-TOF-MS對組分P1和組分P3進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)組分P1峰值m/z=1473.485、1487.542、1501.594、1515.646和1529.684 Da（圖5-A），分別相差約14.000 Da，這5個離子峰均對應(yīng)fengycins;組分P3峰值m/z=1045.931、1067.560和1083.924 Da處出現(xiàn)了3個相差約14.000 Da的離子峰（圖5-B），對應(yīng)iturins的bacillomycin D，與張學(xué)雯等（2019）報道bacillomycin D的離子峰一致。

3 討論

隨著第一株解淀粉芽孢桿菌FZB42全基因組測序的完成（Chen et al.，2007），對其生防機(jī)理也展開了大量研究。解淀粉芽孢桿菌主要通過分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長發(fā)育。鑒定解淀粉芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)和抑菌機(jī)理是目前的研究熱點(diǎn)。解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物主要通過核糖體途徑和非核糖體途徑合成，前者包括抗菌蛋白和抗菌肽，后者包括脂肽類化合物和聚酮化合物等（劉磊等，2017）。脂肽類化合物一般是由1個β-羥基脂肪酸和7～10個氨基酸肽鏈通過內(nèi)脂鍵而形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Ongena et al.，2005），主要包括iturins、fengycins、surfactins、bacillomycins和mycosubtilins等，其抗真菌、細(xì)菌及病毒的效果均非常明顯。目前，這類抗菌活性物質(zhì)的研究主要集中在芽孢桿菌領(lǐng)域（陳萍等，2015）。不同的解淀粉芽孢桿菌合成的脂肽類化合物不同，即使同一菌株產(chǎn)生的同一種脂肽類化合物也是由幾種結(jié)構(gòu)類似的同系物組成的復(fù)雜化合物（Peypoux et al.，1999）。

本研究通過抑菌試驗(yàn)及盆栽防控試驗(yàn)初步探明菌株GKT04的抑菌物質(zhì)為脂肽類抗生素。為進(jìn)一步明確該菌株產(chǎn)生的脂肽類抗生素的種類，首先通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)菌株GKT04全基因組中存在ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB等合成脂肽類物質(zhì)的相關(guān)基因，說明菌株GKT04具有合成多種脂肽類抗生素的潛能，從分子水平上驗(yàn)證了相關(guān)研究結(jié)果的可靠性。通過HPLC對菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類抗生素粗提物進(jìn)行分離，共得到4個組分。結(jié)合抑菌試驗(yàn)，組分P1和組分P3的抑菌效果明顯。利用MALDI-TOF-MS對組分P1和組分P3進(jìn)行深入檢測分析，發(fā)現(xiàn)組分P1中存在fengycins，組分P3中存在bacillomycin D，與PCR擴(kuò)增到fenA、fenB、bmyA和bmyB基因相符，表明菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類物質(zhì)主要為fengycins和bacillomycin D。Liu等（2011）在研究解淀粉芽孢桿菌C06對桃褐腐病菌抑菌機(jī)理過程中發(fā)現(xiàn)，菌株C06產(chǎn)生的脂肽類抗生素為fengycins和bacillomycin D。向亞萍等（2016）發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B1619分泌的脂肽類抗生素fengycins和baciliomycin L是抑制番茄枯萎病菌生長的主要抑菌物質(zhì)。由此可見，fengycins和bacillomycins在抑制真菌的生長中發(fā)揮重要作用。

Zhao等（2012）認(rèn)為srfA基因是合成surfactins的關(guān)鍵基因，通過改變srfA的表達(dá)量，突變菌株F2-38的surfactins產(chǎn)量提高了3.5～10.3倍。本研究中菌株GKT04未擴(kuò)增到sfp基因，擴(kuò)增到srfA基因，但質(zhì)譜檢測中未檢測到surfactins。surfactins合成基因組序列存在多樣性、surfactins的合成受群集感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控或因surfactins合成產(chǎn)量過低或合成過程受阻均可能導(dǎo)致質(zhì)譜檢測不到surfactins。

4 結(jié)論

利用HPLC對解淀粉芽孢桿菌GKT04產(chǎn)生的脂肽類抗生素進(jìn)行分離，其中組分P1和組分P3的抑菌效果最好，MALDI-TOF-MS分析組分P1的成分為fengycins，組分P3的成分為bacillomycin D。

參考文獻(xiàn)：

陳萍，馮芬，楊恬然，辛明秀. 2015. 脂肽類抗生素及其作用機(jī)制[J]. 微生物學(xué)雜志，35（5）： 89-93. [Chen P，F(xiàn)eng F，Yang T R，Xin M X. 2015. Lipopeptide antibiotics and its action mechanism[J]. Journal of Microbiology，35（5）： 89-93.]

黃素梅，韋紹龍，韋莉萍，李朝生，覃柳燕，韋弟，田丹丹，龍盛風(fēng)，何章飛，周維. 2019. 8種香蕉種質(zhì)對枯萎病的抗性比較與分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，40（11）：2189-2196. [Huang S M，Wei S L，Wei L P，Li C S，Qin L Y，Wei D，Tian D D，Long S F，He Z F，Zhou W. 2019. Comparison and analysis of resistance of eight banana accessions to fusarium wilt[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，40（11）：2189-2196.]

劉磊，梁昌聰，曾迪，楊臘英，郭立佳，丁兆建，黃俊生. 2017. 芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物及其在土傳病害防控中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報，38（4）： 775-782. [Liu L，Liang C C，Zeng D，Yang L Y，Guo L J，Ding Z J，Huang J S. 2017. Research progress on secondary metabolites of Bacillus spp. and their applications in biocontrol of soil-borne diseases[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，38（4）： 775-782.]

劉宇帥，張杰，鐘瑾，李晶，孟利強(qiáng)，張淑梅. 2018. 解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌脂肽芬芥素的分離鑒定及抑菌作用[J]. 中國生物工程雜志，38（10）：20-29. [Liu Y S，Zhang J，Zhong J，Li J，Meng L Q，Zhang S M. 2018. Isolation and identification of antibacterial lipopeptides fengycin produced by Bacillus amyloliquefaciens TF28 and its anti-fungal mechanism studies[J]. China Biotechnology，38（10）：20-29.]

宋莉莎，司世飛，龍友華，劉仁祥，李忠. 2019. 煙草赤星病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及其生長條件研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（1）：84-89. [Song L S，Si S F，Long Y H，Liu R X，Li Z. 2019. Isolation，identification and growth conditions analysis of antagonistic Bacillus against tobacco brown spot[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，48（1）：84-89.]

田丹丹，周維，覃柳燕，韋莉萍，龍盛風(fēng)，李朝生，黃素梅，韋弟，韋紹龍. 2018. 香蕉枯萎病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及防治效果初探[J]. 熱帶作物學(xué)報，39（10）： 2007-2013.[Tian D D，Zhou W，Qin L Y，Wei L P，Long S F，Li C S，Huang S M，Wei D，Wei S L. 2018. Isolation，identification and control effection of antagonistic endophytic bacterium against fusarium wilt[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，39（10）： 2007-2013.]

王帥. 2009. 芽孢桿菌及其脂肽類化合物防治植物病害和促進(jìn)植物生長的研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wang S. 2009. Plant growth promotion and control of plant disease with Bacillus spp. and lipopeptide[D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University.]

向亞萍，周華飛，劉永鋒，陳志誼. 2016. 解淀粉芽孢桿菌B1619脂肽類抗生素的分離鑒定及其對番茄枯萎病菌的抑制作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，49（15）：2935-2944. [Xiang Y P，Zhou H F，Liu Y F，Chen Z Y. 2016. Isolation and identification of lipopeptide antibiotics produced by Bacillus amyloliquefaciens B1619 and the inhibition of the lipopeptide antibiotics to Fusarium oxysporun f. sp. lycopersici[J]. Scientia Agricultura Sinica，49（15）：2935-2944.]

張榮勝，王曉宇，羅楚平，劉永峰，劉郵洲，陳志誼. 2013. 解淀粉芽孢桿菌Lx-11產(chǎn)脂肽類物質(zhì)鑒定及表面活性素對水稻細(xì)菌性條斑病的防治作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（10）：2014-2021. [Zhang R S，Wang X Y，Luo C P，Liu Y F，Liu Y Z，Chen Z Y. 2013. Identification of the lipopeptides from Bacillus amyloliquefaciens Lx-11 and biocontrol efficacy of surfactin against bacterial leaf streak[J]. Scientia Agricultura Sinica，46（10）：2014-2021.]

張學(xué)雯，王奕丁，李紅亞，王樹香，王全，李術(shù)娜. 2019. 黃曲霉拮抗菌B10-6-1脂肽類抗生素粗提物的性質(zhì)與抑菌機(jī)理研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，58（14）：70-75. [Zhang X W，Wang Y D，Li H Y，Wang S X，Wang Q，Li S N. 2019. Isolation and identification of lipopeptide produced by Bacillus amyloliquefaciens B10-6-1 antagonistic to Apergillus flavus[J]. Hubei Agricultural Sciences，58（14）：70-75.]

張忠良，劉東平，潘培培，何夢菡，邢小萍，申順善. 2019. 多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）K18-5不同懸浮液處理對黃瓜枯萎病抑制作用的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，53（5）：724-730. [Zhang Z L，Liu D P，Pan P P，He M H，Xing X P，Shen S S. 2019. Influence of inhibition effects of different suspensions treatments of Paenibaci-llus polymyxa（K18-5） against Fusarium wilt of cucumber[J]. Journal of Henan Agricultural University，53（5）：724-730.]

Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，Eisenreich A，Schneider K，Heinemeyer I，Morgenstern B，Voss B，Hess W R，Reva O，Junge H，Voigt B，Jungblut P R，Vater J，Süssmuth R，Liesegang H，Strittmatter A，Gottschalk G，Borriss R. 2007. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacteriun Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Nature Biotechnology，25（9）：1007-1014.

Koumoutsi A，Chen X H，Henne A，Liesegang H，Hitzeroth G，F(xiàn)ranke P，Vater J，Borriss R. 2004. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Baci-llus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Journal of Bacteriology，186（4）：1084-1096.

Liu J，Zhou T，He D，Li D，Wu H，Liu W，Gao X. 2011. Functions of lipopetides bacillomycin D and fengycin in antagonism of Bacillusa myloliquefaciens C06 towards Monilinia fructicola[J]. Journal of Molecular Microbilogy and Biotechnology，20（1）：43-52.

Ongena M，Jacques P. 2008. Bacillus lipopeptides：Versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology，16（3）： 115-125.

Ongena M，Jourdan E，Adam A，Paquot M，Brans A，Joris B，Arpigny J L，Thonart P. 2007. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants[J]. Environmental Microbiology，9（4）： 1084-1090.

Ongena M，Jacques P，Touré Y，Destain J，Jabrane A，Thonart P. 2005. Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential of Bacillus subtilis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，69（1）： 29-38.

Tsuge K，Akiyama T，Shoda M. 2001. Cloning，sequencing and characterization of the iturin A operon[J]. Journal of Bacteriology，183（21）： 6265-6273.

Peypoux F，Bonmatin J M，Wallach J. 1999. Recent trends in the biochemistry of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，51（5）： 553-563.

Romero D，De Vicente A，Olmos J L，Dávila J C，Péreza-García A. 2007. Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen Podosphaera fusca[J]. Journal of Applied Microbiology，103（4）： 969-976.

Zeriouh H，Romero D，Garcia-Gutierrez L，Cazorla F M，de Vicente A，Péreza-García A. 2011. The iturin-like lipopeptides are essential components in the biological control arsenal of Bacillus subtilis against bacterial diseases of cucurbits[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，24（12）： 1540-1552.

Zhao J F，Li Y H，Zhang C，Yao Z Y，Zhang L，Bie X? M，Lu F X，Lu Z X. 2012. Genome shuffling of Bacillus amyloliquefaciens for improving antimicrobial lipopeptide production and an analysis of relative gene expression using FQ RT-PCR[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，39（6）： 889-896.

（責(zé)任編輯 麻小燕）