紫外線誘變玫煙色棒束孢IF-1106菌株最佳條件的篩選

黃開云 任高雅 田晶

摘? ? 要：為探究紫外線誘變玫煙色棒束孢IF-1106菌株的最佳條件，本研究以玫煙色棒束孢IF-1106菌株為對(duì)象、紫外線為誘變條件，通過單因素試驗(yàn)，分別選取3個(gè)較合適的孢子懸浮液濃度、紫外線誘變時(shí)間、紫外線誘變距離進(jìn)行正交試驗(yàn)，并以菌落直徑和產(chǎn)孢量為指標(biāo)進(jìn)行條件篩選。結(jié)果表明，不同的孢子懸浮液濃度、紫外線誘變時(shí)間、紫外線誘變距離均可對(duì)菌落直徑及產(chǎn)孢量產(chǎn)生影響。其中在菌株的孢子懸浮液濃度為1.0×106 cfu·mL-1、處理時(shí)間為10 min、距離為30 cm的條件下試驗(yàn)結(jié)果最佳，在此誘變條件下，玫煙色棒束孢IF-1106菌株菌落直徑為38.08 mm，產(chǎn)孢量1.26×107 cfu·mL-1。綜合而言，最適紫外線誘變玫煙色棒束孢IF-1106菌株的孢子懸浮液濃度為1.0×106 cfu·mL-1、處理時(shí)間為10 min、距離為30 cm。

關(guān)鍵詞：玫煙色棒束孢;紫外線誘變;菌落直徑;產(chǎn)孢量;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q968.1? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.04.002

Abstract： In order to explore the best conditions of ultraviolet mutagenic Isaria fumosorosea IF-1106 strain， this study took the Isaria fumosorosea IF-1106 strain as the object， uv radiation as the mutagenic condition， through a single factor experiment， selected three more suitable spore suspension concentration， ultraviolet mutagenic time， ultraviolet mutagenic distance for orthogonal experiment . The optimum condition of IF-1106 strain induced by ultraviolet radiation was selected with the colony diameter and sporulation quantity as the indexes.? The experimental results showed that different spore suspension concentrations， UV mutagenic time and UV mutagenic distance could all affect the colony diameter and the sporulation quantity. Among them， the sporesuspension concentration of the strain was 1.0×106 cfu·mL-1， the treatment time was 10 min， the distance was 30 cm， the test results were best.In this condition ，the colony diameter was 38.08 mm， the production of 1.26×107 cfu·mL-1. In general， the most suitable UVmutagenic Isaria fumosorosea IF-1106 strain spore suspension concentration was 1.0 ×106 cfu·mL-1， treatment time was 10 min， distance was 30 cm.

Key words： Isaria fumodorosea; ultraviolet mutagenesis; colony diameter; sporulation; orthogonal experiment

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）原稱玫煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus）[1]，目前已被開發(fā)為微生物殺蟲劑且為重要昆蟲病原真菌，它可以寄生在多種昆蟲及土壤中，一旦條件適宜，就可以進(jìn)行繁殖產(chǎn)生孢子[2]。隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量農(nóng)藥的使用使農(nóng)業(yè)害蟲產(chǎn)生了抗藥性且數(shù)量驟增，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，造成經(jīng)濟(jì)損失。農(nóng)業(yè)防治、生物防治等利用生態(tài)系統(tǒng)中各種生物之間相互依存、相互制約以達(dá)到減少有害生物的方法逐漸成為主流。玫煙色棒束孢的分布范圍很廣，其寄主范圍也相當(dāng)廣泛，包括半翅目、雙翅目、鞘翅目等[3]。玫煙色棒束孢不但可以防治害蟲，而且可以防治植物病害和線蟲。有研究發(fā)現(xiàn)玫煙色棒束孢可侵染煙粉虱所有蟲態(tài)，且對(duì)其2齡若蟲致病力最高，可作為防治該害蟲的高效菌株[4]。近年來國內(nèi)有關(guān)其生物學(xué)、分類、生化和應(yīng)用的研究仍然較少[5]。

紫外線誘變是一種使微生物基因改變的物理誘變因素，它能使DNA上兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶相聯(lián)結(jié)形成胸腺嘧啶二聚體， 從而使DNA的空間構(gòu)象發(fā)生改變[6]。有研究表明，紫外線誘變能影響玫煙色棒束孢分生孢子的萌發(fā)率，適宜的紫外線照射可以提高玫煙色棒束孢的產(chǎn)孢能力，提高其對(duì)害蟲的致病力（紫外線誘變10 min對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾的致病能力最強(qiáng)，對(duì)其農(nóng)業(yè)害蟲的致死時(shí)間僅為1.97 d）[7]。因此，本研究將玫煙色棒束孢經(jīng)過不同的紫外線照射時(shí)長、照射距離及不同的孢子濃度處理后，接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量以獲得最佳紫外線誘變條件，為深入研究玫煙色棒束孢提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢IF-1106菌株，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。使用時(shí)，取出活化[8]，然后接種到PDA培養(yǎng)基平板上[9]，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于制作孢子懸浮液。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，瓊脂34 g，蒸餾水2 L。

1.2 方法與步驟

1.2.1 孢子懸浮液的配置 在超凈工作臺(tái)中，將活化好的菌種接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用無菌刀輕輕刮取菌株，再用無菌水收集玫煙色棒束孢的分生孢子，用磁力攪拌器將分生孢子打散后，用四層無菌紗布過濾到小燒杯中再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)之后調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1.0×107 cfu·mL-1[10]，用磁力攪拌器攪拌混合均勻備用[5]。

1.2.2 菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)定 取培養(yǎng)后的菌落觀察，用直尺測(cè)量直徑并記錄下來;測(cè)量完菌落直徑之后，用滅菌后的打孔器在各培養(yǎng)基的菌落中心（濾紙片處）至邊緣處打孔，每個(gè)菌落打5個(gè)孔，且5個(gè)菌餅的位置在各個(gè)培養(yǎng)基中基本保持一致。將5個(gè)菌餅置于5 mL無菌水中，用玻璃棒將其攪拌均勻，用兩層滅過菌的紗布過濾后即為孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)母液的孢子濃度[11]，最終用公式計(jì)算其產(chǎn)孢量（本試驗(yàn)采用湯麥?zhǔn)窖蛴?jì)數(shù)器，其產(chǎn)孢量計(jì)算公式為：80個(gè)小方格孢子總數(shù)/80×4×106 cfu·mL-1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) （1）玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度的確定。在上一步的基礎(chǔ)上將孢子懸浮液濃度稀釋為5.0×106，1.0×106，5.0×105和1.0×105 cfu·mL-1，將5種濃度的懸浮液在紫外線照射時(shí)長10 min、距紫外線燈30 cm處的條件下處理后重新接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)好后測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

（2） 紫外線照射時(shí)間的確定。 在選取最適孢子液濃度及紫外線燈距離的條件下，設(shè)置5個(gè)不同紫外線照射時(shí)間：5，10，15，20和25 min，處理后重新接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)好后測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

（3）與紫外線燈照射距離的確定。在選取最適孢子液濃度及紫外線燈照射時(shí)間（時(shí)長）的條件下，設(shè)置五個(gè)不同紫外線照射距離：10，20，30，40和50 cm，處理后重新接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)好后測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別選取3個(gè)不同的玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度、3個(gè)紫外線照射時(shí)間、3個(gè)與紫外線燈的距離進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)。將測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得出結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)量得到的數(shù)據(jù)用SPSS17.0（中文版）數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)處理，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差，選取3個(gè)較適合的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度的確定 紫外誘變后玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度對(duì)菌落直徑的影響如圖1所示。從圖中可以看出，不同濃度的孢子懸浮液經(jīng)紫外誘變后對(duì)菌落直徑有影響，部分濃度之間差異顯著（P<0.05）。隨著玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度的增大，菌落直徑先增大后減小。菌落直徑最大為38.2 mm，其次是36.6，36.5，29.1和18.7 mm。選取菌落直徑較大的3個(gè)濃度（5.0×106，1.0×106和5.0×105 cfu·mL-1）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

紫外誘變后玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度對(duì)產(chǎn)孢量的影響如圖2所示。從圖中可以看出，不同濃度的孢子懸浮液經(jīng)紫外線誘變后對(duì)產(chǎn)孢量有一定影響，且相互之間存在差異，有些誘變距離之間差異顯著（P<0.05）。隨著玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度的增大，產(chǎn)孢量先增大后減小。產(chǎn)孢量最大為1.22×107 cfu·mL-1，其次是1.06×107，1.05×107 cfu·mL-1、0.79×107和0.75×107 cfu·mL-1。選取產(chǎn)孢量較大的3個(gè)濃度（5.0×106，1.0×106和5.0×105·mL-1）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

2.1.2 紫外線誘變玫煙色棒束孢孢子懸浮液時(shí)間的確定? ? ?在1.0×106 cfu·mL-1玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度下，不同的紫外線誘變時(shí)長對(duì)菌落直徑的影響如圖3所示。從圖3可以看出，在濃度不變的條件下，紫外線誘變時(shí)長對(duì)菌落直徑有較大影響，誘變時(shí)長分別為10，15，20和25min時(shí)差異顯著（P<0.05）。隨著紫外線誘變時(shí)間的增大，菌落直徑先增大后減小。菌落直徑最大為36.0 mm，其次是34.8，34.7，32.0和28.3 mm。選取菌落直徑較大的3個(gè)時(shí)間（5，10 和15 min）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

在1.0×106 cfu·mL-1玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度下，不同的紫外線誘變時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響如圖4所示。從圖中可以看出，在濃度不變的條件下，不同的紫外線誘變時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響部分差異顯著（P<0.05）。隨著紫外線誘變時(shí)間的增大，產(chǎn)孢量先增大后減小。產(chǎn)孢量最大為1.04×107 cfu·mL-1，其次是0.83×107，0.80×107，0.54×107和0.32×107 cfu·mL-1。選取產(chǎn)孢量較大的3個(gè)時(shí)間（5，10和15 min）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

2.1.3 紫外線誘變玫煙色棒束孢孢子懸浮液距離的確定 在1.0×106 cfu·mL-1玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度下，不同的紫外線誘變距離對(duì)菌落直徑的影響如圖5所示。從圖中可以看出，在濃度不變的條件下，不同的紫外線誘變距離對(duì)菌落直徑的影響不同，相互之間存在差異（P<0.05），也存在無明顯差異距離。隨著紫外線誘變距離的增大，菌落直徑先增大后減小。菌落直徑最大為37.6 mm，其次是35.2，35.1，30.8和29.3 mm。選取菌落直徑較大的三個(gè)距離（20，30和40 cm）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

在1.0×106 cfu·mL-1玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度下，不同的紫外線誘變距離對(duì)產(chǎn)孢量的影響如圖6所示。從圖中可以看出，在濃度不變的條件下，紫外線誘變距離對(duì)產(chǎn)孢量有影響，不同誘變距離之間有差異，且部分距離之間存在明顯差異（P<0.05）。隨著紫外線誘變距離的增大，產(chǎn)孢量先增大后減小。產(chǎn)孢量最大為1.17×107 cfu·mL-1，其次是1.05×107，1.01×107，0.64×107和0.61×107 cfu·mL-1。選取產(chǎn)孢量較大的3個(gè)距離（20，30和40 cm）作為正交試驗(yàn)因素的水平。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果得到了數(shù)據(jù)的選取范圍，將玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度、紫外線誘變距離、紫外線誘變時(shí)間這3個(gè)因素各設(shè)置3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平如表1所示。

正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)綜合分析結(jié)果如下表2和表3所示。

如表2所示，以菌落直徑為指標(biāo)，極差分析表明，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)因素對(duì)玫煙色棒束孢菌落直徑的影響大小依次為：時(shí)間、距離、濃度，可見，時(shí)間對(duì)玫煙色棒束孢菌落直徑的影響最大。最終得出的最優(yōu)方案為：紫外線照射時(shí)間10 min，與紫外線燈距離30 cm，孢子懸浮液濃度1.0×106 cfu·mL-1。

如表3所示，以產(chǎn)孢量為指標(biāo)，極差分析表明，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)因素對(duì)玫煙色棒束孢產(chǎn)孢量的影響大小依次為：時(shí)間、距離、濃度，可見時(shí)間對(duì)玫煙色棒束孢產(chǎn)孢量的影響最大。最終得出的最優(yōu)方案為：紫外線照射時(shí)間10 min，與紫外線燈距離30 cm，孢子懸浮液濃度1.0×106 cfu·mL-1。為檢測(cè)結(jié)果的可靠性，采用最優(yōu)方案做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的菌落直徑為38.08 mm，產(chǎn)孢量1.26×107 cfu·mL-1。

綜上所述，最適合玫煙色棒束孢的紫外線誘變條件為：紫外線照射時(shí)間10 min，與紫外線燈距離30 cm，玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度1.0×106 cfu·mL-1。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以玫煙色棒束孢IF-1106菌株為研究對(duì)象，以培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的菌落直徑及產(chǎn)孢量為指標(biāo)，分析得出最適合紫外線誘變玫煙色棒束孢的條件為：玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度為1.0×106 cfu·mL-1、紫外線照射時(shí)間為10 min、紫外線照射距離為30 cm。在此條件下得到的菌落直徑為38.08 mm，產(chǎn)孢量1.26×107 cfu·mL-1。

大多數(shù)致病真菌可以對(duì)類酮物質(zhì)進(jìn)行糖化[12]，侵染昆蟲后，通過次生代謝物質(zhì)引發(fā)昆蟲病變而死亡。最新研究表明，該代謝物質(zhì)不僅可以殺蟲，還具有促進(jìn)植物生長的生理功能[13]，因此玫煙色棒束孢在生物防治和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面表現(xiàn)出巨大潛力[14]。

該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玫煙色棒束孢菌落直徑和產(chǎn)孢量均隨紫外線照射時(shí)長梯度和距離梯度的變化呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。且有人研究環(huán)境因素對(duì)該菌的影響得出的結(jié)論為：隨著紫外線照射時(shí)長的增加，孢子萌發(fā)率明顯下降[15]。因此推斷出玫煙色棒束孢IF-1106菌株對(duì)紫外線照射時(shí)長及距離具有一定的耐受限度。同時(shí)隨著紫外線誘變方法研究的深入，很多科研工作者為尋求進(jìn)一步的突破曾嘗試過對(duì)孢子原生質(zhì)體直接進(jìn)行誘變，其效果并不明顯優(yōu)于對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行誘變[16]。

玫煙色棒束孢的相關(guān)試驗(yàn)雖然日益增多，但由于其實(shí)踐應(yīng)用效果不夠穩(wěn)定，直接投入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)還存在許多問題，應(yīng)基于理論基礎(chǔ)加大該菌實(shí)踐應(yīng)用方面研究的力度。

參考文獻(xiàn)：

[1]王成.玫煙色棒束孢的遺傳多態(tài)性[D].貴陽：貴州大學(xué)，2017.

[2]浦靜，彭鑫，朱麗梅，等.玫煙色棒束孢培養(yǎng)條件的研究[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，32（4）：76-79.

[3]羅瑩，趙晶，黃振，等.昆蟲病原真菌紫外線誘變育種研究進(jìn)展[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2015，37（5）：1085-1092.

[4]TIAN J， DIAO H， LIANG L， et al. Pathogenicity of Isaria fumosorosea to Bemisia tabaci， with some observations on the fungal infection process and host immune response[J]. Journal of

invertebrate pathology， 2015， 130（Complete）：S0022201115300021.

[5]陳巍巍，馮明光.玫煙色擬青霉的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].昆蟲天敵，1999（3）：140-144.

[6]田晶，郝赤，梁麗，等.溫濕度對(duì)玫煙色棒束孢IF-1106菌株孢子萌發(fā)及對(duì)煙粉虱致病力的影響（英文）[J].菌物學(xué)報(bào)，2014，33（3）：668-679.

[7]王興民，羅瑩，龍秀珍，等.紫外線誘變對(duì)玫煙色棒束孢生物學(xué)特性的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46（7）：1213-1217.

[8]王宏民，張奐，郝赤，等.玫煙色棒束孢侵染對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)不同酶活的影響[J].菌物學(xué)報(bào)，2013，32（2）：269-276.

[9]張偉，呂利華，何余容，等.環(huán)境因子及常用農(nóng)藥對(duì)玫煙色棒束孢SCAU-IFCF01孢子萌發(fā)的影響[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（1）：49-55.

[10]梁麗，田晶，馬瑞燕.玫煙色棒束孢研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2013，33（4）： 362-368.

[11]田晶，梁麗，李新鳳.玫煙色棒束孢IF-1106菌株對(duì)煙粉虱的致病力[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）： 728-731.

[12]DYMARSKA M， GRZESZCZUK J， URBANIAK M， et al. Glycosylation of 6-methylflavone by the strain Isaria fumosorosea KCH J2[J]. PLOS ONE， 2017， 12（10）e0184885.

[13]王成，陳萬浩，韓燕峰.重要昆蟲病原真菌玫煙色棒束孢的研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（10）：74-76.

[14]MARK A， JACKSO N， MICHAEL R，et al. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus[J]. Mycological research， 1997，101（1）：35-41.

[15]田晶，李雅，刁紅亮，等.環(huán)境因子對(duì)玫煙色棒束孢IF-1106菌株孢子萌發(fā)的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 22（4）：8-12.

[16]王宏民，張未仲，張仙紅，等.玫煙色擬青霉Pf9606菌株的紫外誘變選育[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2009， 25（1）：165-168.