高溫好氧堆肥過(guò)程中芽孢桿菌的篩選、鑒定及應(yīng)用

余培斌，杜晶，陳建新

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)4(江蘇一鳴生物股份有限公司，江蘇 泰州，225433)

餐廚垃圾是指學(xué)校、公共食堂和餐飲業(yè)產(chǎn)生的食品廢物[1]，包括剩菜、剩飯、飲料、丟棄的水果、糧食及食物湯汁等人們?nèi)粘２惋嫽顒?dòng)中所產(chǎn)生的垃圾，俗稱(chēng)泔腳，是城市生活垃圾的重要組成部分[2]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民生活水平日益提高，餐廚垃圾數(shù)量也在不斷增加，一般可以達(dá)到生活垃圾總量的30%～50%，每年還在以8%～10%的速度增長(zhǎng)[3]。近幾年隨著我國(guó)主要城市生活垃圾分類(lèi)工作的推進(jìn)，實(shí)現(xiàn)生活垃圾的減量化、資源化和無(wú)害化處理已經(jīng)是城鎮(zhèn)化過(guò)程必須面對(duì)和解決的難題[4]。如何簡(jiǎn)單高效的處理餐廚垃圾成為目前需要迫切解決的問(wèn)題。從化學(xué)組成上看，餐廚垃圾成分包括淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和少量無(wú)機(jī)鹽等幾大常見(jiàn)類(lèi)別[5]。餐廚垃圾憑借高有機(jī)物、高含水率、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，成為寶貴的可再生資源，蘊(yùn)含著很大的回收和再利用價(jià)值[6-8]。目前餐廚垃圾的資源化處理技術(shù)包括微生物飼料制作、堆肥制有機(jī)肥、厭氧消化、微生物制氫等[9-11]；非資源化處理技術(shù)包括焚燒、填埋、粉碎直排等。餐廚垃圾處理優(yōu)先順序?yàn)樵搭^減量、工業(yè)利用、堆肥、焚燒/填埋，目前主要發(fā)達(dá)國(guó)家傾向于采用堆肥制肥料或加工成飼料的資源化回收利用方式[12-14]。

餐廚垃圾好氧堆肥技術(shù)是利用好氧微生物的生命活動(dòng)，將餐廚垃圾中有機(jī)物通過(guò)微生物的作用分解成腐殖質(zhì)并形成穩(wěn)定產(chǎn)品的過(guò)程[15]，客觀(guān)上減小了餐廚垃圾對(duì)環(huán)境的污染。該技術(shù)也因兼具固態(tài)發(fā)酵能耗低、方便實(shí)用，能夠充分分解轉(zhuǎn)化餐廚垃圾的特點(diǎn)，被逐漸推廣開(kāi)來(lái)，成為餐廚垃圾資源化利用的重要手段之一。在較高溫度下進(jìn)行的好氧堆肥也被稱(chēng)為高溫好氧堆肥法。高溫好氧堆肥相對(duì)于常溫靜態(tài)堆肥，具有減量化迅速，設(shè)備占地空間小等顯著優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)堆肥過(guò)程中所產(chǎn)生的持續(xù)高溫也有利于去除原料中所帶來(lái)的病原微生物、蟲(chóng)卵和雜草種子等[16-17]。加快堆肥過(guò)程，獲得優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥，微生物是關(guān)鍵，傳統(tǒng)堆肥最常見(jiàn)的方式是自然通風(fēng)靜態(tài)堆肥，利用餐廚垃圾土著微生物自然生長(zhǎng)繁殖分解有機(jī)質(zhì)，這種堆肥方式成本較低，技術(shù)簡(jiǎn)單，但堆肥時(shí)間長(zhǎng)，占地面積大。且物料堆內(nèi)部通風(fēng)不暢，氧氣不易進(jìn)入，會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，堆肥的產(chǎn)品質(zhì)量也難保證[18]。已有研究表明接種特定功能微生物可以增加堆肥初期微生物的群體數(shù)，提高微生物群體活性，縮短到達(dá)高溫期的時(shí)間，加快有機(jī)物的分解，明顯縮短堆肥化周期[19]。國(guó)外對(duì)堆肥接種微生物菌劑的研究較為充分。20世紀(jì)40年代，美國(guó)通過(guò)接種細(xì)菌使堆肥時(shí)間縮短1～3 d；20世紀(jì)70年代，日本研制的 EM 菌劑加快了堆肥的效率，10～15 d 可使堆肥腐熟[20]。目前已經(jīng)商業(yè)化的餐廚垃圾高溫堆肥箱多使用從日本引進(jìn)的EM菌劑。由于日本和中國(guó)在飲食方面的巨大差別，EM菌劑在實(shí)際使用過(guò)程中存在肥堆升溫慢，減重少，腐熟度不夠等各種問(wèn)題。因此，篩選適合中國(guó)餐廚垃圾高溫堆肥的功能微生物具有重要意義。

本研究從完全腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥料中，篩選出適合餐廚垃圾高溫好氧堆肥的芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和耐受性研究，以解決餐廚垃圾高溫堆肥箱在堆肥過(guò)程中存在的各種問(wèn)題。為開(kāi)發(fā)適合國(guó)內(nèi)餐廚垃圾堆肥的復(fù)合菌劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品來(lái)源于學(xué)校食堂，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的餐廚垃圾分別堆放于不同土壤環(huán)境中至完全腐熟，采集堆肥樣品于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

(1) 牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.4～7.6。

(2) 富集培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉3，蛋白胨10，酵母膏3，KH2PO41.5，K2HPO42，MgSO40.1，pH 7.4～7.6。

(3) 半固體瓊脂培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂4.0～5.0，pH 7.4～7.6。

(4) 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉3.0，蛋白胨10.0，牛肉膏3.0～5.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0～20.0，pH 7.2～7.4。

(5) 剛果紅纖維素培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏2.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，CMC-Na 3.0，剛果紅0.1，瓊脂20.0，pH自然。

(6) 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基(g/L)：脫脂奶粉15.0，蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0，pH 7.3～7.5。脫脂奶粉用水溶解后單獨(dú)滅菌，滅菌后再混合，倒平板。

(7) 產(chǎn)脂肪酶菌株篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0， KH2PO41.2，K2HPO41.8，NH4Cl 4，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CH3CH2COONa 2.5，瓊脂15.0，橄欖油乳化液50 mL，每100 mL培養(yǎng)基中加入0.2 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))的維多利亞藍(lán)B，pH 7.2～7.4。

(8) 橄欖油乳化液制備：將橄欖油與2.5%(體積分?jǐn)?shù))的Triton X-100以1∶4的體積比混合后，冰浴條件下，用超聲破碎儀進(jìn)行超聲乳化。超聲條件為功率50%(375 W)，工作1 s停止3 s，工作4 min。

(9) 鹽耐受性驗(yàn)證培養(yǎng)基：NaCl 4～8 g，牛肉膏0.3 g，葡萄糖0.1 g，蛋白胨1.0 g，溴甲酚紫指示劑適量，瓊脂粉1.8 g，蒸餾水100 mL，pH 7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的初篩與分離純化

菌種富集：稱(chēng)取堆肥樣品5 g，加入含有100 mL無(wú)菌牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中(內(nèi)置玻璃珠)，置于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴15～20 min(熱處理)，放入200 r/min、45 ℃的搖床中培養(yǎng)24 h以上。

菌種初篩：將富集培養(yǎng)的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)来蔚玫?0-1～10-4的菌液。取10-2、10-3和10-4三個(gè)梯度的菌液各0.2 mL分別涂布于牛肉膏-蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，45 ℃倒置培養(yǎng)12 h以上觀(guān)察。

菌種分離純化：挑取初篩平板上形態(tài)不同的菌落劃線(xiàn)于牛肉膏-蛋白胨平板上，對(duì)菌落進(jìn)行編號(hào)，多次劃線(xiàn)直至分離出的單菌落形態(tài)穩(wěn)定一致。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀(guān)察

平板菌落觀(guān)察：菌落顏色、形狀、邊緣、大小、透明度及有無(wú)凸起。菌體形態(tài)及染色觀(guān)察：油鏡下菌體普通染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)、大小、排列；革蘭氏染色；芽孢染色觀(guān)察芽孢著生特點(diǎn)。

1.2.3 菌種產(chǎn)酶性能及耐受性

產(chǎn)酶性能：取分離純化得到的菌株，以及來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室已鑒定的枯草芽孢桿菌YB6和解淀粉菌YB7分別點(diǎn)樣于產(chǎn)淀粉酶篩選培養(yǎng)基、剛果紅纖維素培養(yǎng)基、產(chǎn)蛋白酶篩選培養(yǎng)基和產(chǎn)脂肪酶篩選培養(yǎng)基平板上，置于45 ℃培養(yǎng)24 h觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況，有無(wú)透明圈，并測(cè)定透明圈與菌落直徑的比值(D/d值)，比較各菌株產(chǎn)酶性能。

菌種耐受性實(shí)驗(yàn)：耐溫性，將獲得的單菌落接種于牛肉膏-蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，每個(gè)菌落做1個(gè)對(duì)照，分別置于4、20、50、55和60 ℃下培養(yǎng)，觀(guān)察并記錄菌體生長(zhǎng)狀況，極限環(huán)境下可多培養(yǎng)幾天再觀(guān)察。耐鹽性，將各菌株接種在不同鹽度(NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～8%)的LB培養(yǎng)基平板上，觀(guān)察菌株是否生長(zhǎng)及長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

采用大連寶生物工程有限公司細(xì)菌16S rDNA提取與擴(kuò)增專(zhuān)用試劑盒。擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物，正向引物5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，反向引物5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL反應(yīng)體系：4 μL裂解上清液，25 μL PCR Premix Taq，正向引物與反向引物各0.5 μL，20 μL超純水。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送樣上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

獲得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST并利用DNAMAN4.0、MEGA5.1軟件進(jìn)行多重序列比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)定為1 000。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

正常生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)曲線(xiàn)用LB液體培養(yǎng)基接種入選菌株，放入200 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、12、16、20、24 h取培養(yǎng)液測(cè)定OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

非正常生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)曲線(xiàn)：用LB液體培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)6%的NaCl，5%的橄欖油乳化液)接種入選菌株，放入200 r/min，55 ℃搖床培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、12、16、20、24、36、48、60、72、84、96、108 h取培養(yǎng)液測(cè)定OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.6 堆肥反應(yīng)器及堆肥方法

堆肥反應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖1所示，堆肥箱總?cè)莘e約43.0 L，不銹鋼材質(zhì)，整個(gè)箱體由保溫層覆蓋，加蓋，箱體裝有通氣泵，泵底具有一個(gè)排氣孔，正常通氣量標(biāo)準(zhǔn)為2.5 L/min，還可由連接的控制裝置通過(guò)通斷電來(lái)改變通氣量。保溫層內(nèi)部連接有加熱絲，配備控溫系統(tǒng)，溫度設(shè)定后可自動(dòng)調(diào)節(jié)，攪拌速度可通過(guò)變頻器及減速機(jī)調(diào)節(jié)，整套設(shè)備具有稱(chēng)重系統(tǒng)，可以檢測(cè)堆肥過(guò)程中重量損失，能夠較好地滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

圖1 試驗(yàn)堆肥反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖
Fig.1 The composting reactor structure

堆肥方法采用高溫好氧堆肥方式。堆肥試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將鋸木屑與預(yù)處理的餐廚垃圾以一定比例加入反應(yīng)箱體，總添加量約30 kg。調(diào)節(jié)含水率(質(zhì)量分?jǐn)?shù))在50%～60%。調(diào)節(jié)主輔料添加比例使C/N在25∶1～30∶1，攪拌轉(zhuǎn)速25 r/min，設(shè)定堆肥溫度55 ℃，通氣泵初始設(shè)定為開(kāi)∶關(guān)=5 s∶5 s。

1.2.7 堆肥過(guò)程中水解酶活的測(cè)定

粗酶液制取：稱(chēng)取堆肥樣品10 g，加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液50 mL，30 ℃恒溫水浴1 h，每15 min搖晃1次，濾紙過(guò)濾，得粗酶液。

酶活力測(cè)定：淀粉酶酶活采用鈍化法測(cè)定[21]，根據(jù)實(shí)際情況略有改動(dòng)；蛋白酶酶活采用福林酚法[22]；纖維素酶酶活采用DNS法測(cè)定[23]；脂肪酶酶活采用酸堿滴定法測(cè)定[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離和純化

2.1.1 菌落形態(tài)特征

在不同環(huán)境中腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥中取得堆肥樣品共計(jì)15份，通過(guò)熱處理使目標(biāo)微生物不斷富集。經(jīng)過(guò)LB培養(yǎng)基平板劃線(xiàn)，共獲得單菌落46株，通過(guò)菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察，排除相似及疑似菌株后共獲得8株形態(tài)各異的菌株，分別編號(hào)為YB1、YB2、YB3-1、YB3-2、YB4-1、YB4-2、YB4-3和YB5。將8株菌在LB培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線(xiàn)，待長(zhǎng)出單菌落后，觀(guān)察菌落形態(tài)。菌落形態(tài)如圖2所示，其中正中間為8株菌在同一個(gè)平板上的照片。

a-YB1；b-YB2;c-YB3-1;d-YB3-2;e-8株菌；f-YB4-1； g-YB4-2；h-YB4-3；i-YB5
圖2 菌落形態(tài)
Fig.2 The colony morphology

2.1.2 菌落顯微染色觀(guān)察

將篩選到的8株菌進(jìn)行細(xì)胞染色后，在光學(xué)顯微鏡(10×100倍)油鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)特征及染色情況，菌株顯微形態(tài)如圖3所示。

a-YB1;b-YB2;c-YB3-1;d-YB3-2;e-YB4-1;f-YB4-2; g-YB4-3;h-YB5
圖3 菌株的顯微形態(tài)
Fig.3 The microscopic morphology of the strains

2.2 菌種產(chǎn)酶性能測(cè)試

將篩選到的8株菌與對(duì)照菌(YB6和YB7，來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室前期篩選，已知可產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶)分別點(diǎn)接到淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和油脂篩選培養(yǎng)基平板上，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。向淀粉篩選培養(yǎng)基平板上的菌落周?chē)渭颖R卡氏碘液，用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑，并以此判斷待測(cè)菌株對(duì)淀粉的分解能力。纖維素、蛋白質(zhì)及油脂降解能力則直接由透明圈反應(yīng)來(lái)判斷，記錄各組實(shí)驗(yàn)的D/d值，分析比較大小。透明圈反應(yīng)如圖4所示，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

a-淀粉；b-纖維素；c-蛋白質(zhì)；d-油脂
圖4 菌株產(chǎn)酶透明圈反應(yīng)
Fig.4 Transparent circle reaction of enzyme produced by the strains

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選的8株菌與對(duì)照菌均有分解淀粉的能力，其中YB1、YB2、YB4-1、YB4-2、YB4-3、YB5、YB6和YB7產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)；7株菌(除YB3-2外)與對(duì)照菌均有分解纖維素的能力，其中YB1、YB4-1、YB4-2、YB4-3、YB5和YB6產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)；6株菌(除YB2和YB5外)與對(duì)照菌均有分解蛋白質(zhì)的能力，其中YB1、YB4-3、YB6和YB7產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)；只有3株菌具有分解油脂的能力，其中YB4-1和YB4-2產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)，YB1產(chǎn)脂肪酶能力一般，而對(duì)照菌YB7則不能在油脂環(huán)境下生長(zhǎng)。綜合分析上述各菌株的產(chǎn)酶性能，可以得出YB1、YB4-1和YB4-2對(duì)淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)及油脂具有更強(qiáng)的分解能力。

表1 產(chǎn)酶情況統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of enzyme production

注：+表明產(chǎn)生透明圈，+越多表明透明圈越大;-表明可以生長(zhǎng)，但未見(jiàn)明顯透明圈；N表示不生長(zhǎng)

2.3 菌種耐受性能測(cè)試

堆肥采用高溫好氧堆肥，肥堆溫度會(huì)較長(zhǎng)時(shí)間保持在50～60 ℃，在這種溫度下一般的微生物很難生長(zhǎng)。餐廚垃圾的高含鹽率是中國(guó)餐廚垃圾區(qū)別于其他國(guó)家的主要特征，中國(guó)不同地區(qū)的飲食習(xí)慣也導(dǎo)致餐廚垃圾含鹽率有很大差異[25-26]。鹽對(duì)微生物具有Na+毒性，未經(jīng)馴化的微生物在Na+質(zhì)量濃度為500～2 000 mg/L時(shí)即受輕度抑制[27-28]，隨著Na+質(zhì)量濃度升高，微生物酶活性降低，從而影響整個(gè)體系的堆肥反應(yīng)，肥效降低。因此篩選具有高溫耐受性和高鹽耐受性的微生物十分重要。

2.3.1 溫度耐受性

將篩選到的8株菌接種于LB培養(yǎng)基平板上，置于不同溫度下培養(yǎng)，觀(guān)察各菌株的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株溫度耐受性Table 2 Temperature tolerance of the strains

注：+表示可以生長(zhǎng)，+越多表示菌株生長(zhǎng)越旺盛，N表示不生長(zhǎng)(下同)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,有7株菌能在20～55 ℃下正常生長(zhǎng)(YB5除外，在55 ℃下不能生長(zhǎng))，其中YB1、YB3-1和YB4-1在55 ℃下生長(zhǎng)比較旺盛；有5株菌可以耐受60 ℃高溫而緩慢生長(zhǎng)(除YB2、YB3-2和YB5外)；有2株菌可以在4 ℃低溫下緩慢生長(zhǎng)，即YB1和YB4-1，其他6株菌則不生長(zhǎng)。綜上所述，除YB5外，其余菌株均能在55 ℃及以下快速生長(zhǎng)，具有較高的溫度耐受性。

2.3.2 鹽度耐受性

將篩選的8株菌分別接種于添加了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl的鹽耐受性驗(yàn)證培養(yǎng)基平板上，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表3所示。

表3 菌株鹽度耐受性Table 3 Salinity tolerance of the strains

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各菌株均具有較高的鹽度耐受性，有7株菌(YB5除外，最高耐受6%的鹽度)最高耐受7%的鹽度，相比較而言，YB3-1、YB3-2和YB4-1在7%鹽度下長(zhǎng)勢(shì)旺盛，YB1、YB2、YB4-2和YB4-3在7%鹽度下能夠正常生長(zhǎng)；小于6%的鹽度所有菌株都能正常生長(zhǎng)。綜上所述，篩選的8株菌都有較高的鹽度耐受性。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

綜合考慮各菌株的產(chǎn)酶性能及對(duì)溫度和鹽度的耐受性，選擇YB1、YB4-1和YB4-2作為潛力菌株，用于后續(xù)堆肥實(shí)驗(yàn)。使用試劑盒擴(kuò)增3株菌的16S rDNA序列片段，送上海生工公司測(cè)序，得到16S rDNA基因堿基測(cè)序，將各菌株的堿基序列輸入美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，應(yīng)用BLAST程序，將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中存在細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果如表4所示。

表4 各菌株鑒定結(jié)果Table 4 The identification results of the strains

由表4可知,YB1、YB4-1和YB4-2的堿基序列長(zhǎng)度分別為1 104、1 143和1 077 bp，通過(guò)比對(duì)，確定其分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

2.5 篩選菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)

取已經(jīng)在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h的YB1、YB4-1和YB4-2菌懸液各0.2 mL，分別接種于LB液體培養(yǎng)基(空白)和LB液體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaCl，5%的橄欖油乳化液)中培養(yǎng)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，如圖5所示。

a-正常培養(yǎng)環(huán)境；b-非正常培養(yǎng)環(huán)境
圖5 篩選菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)
Fig.5 The growth curve of screened strains

微生物生長(zhǎng)繁殖分為4個(gè)時(shí)期，分別為停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。3種潛力菌株在正常LB液體培養(yǎng)基環(huán)境中生長(zhǎng)情況如圖5-a，可以看出活化后的菌種轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)液中時(shí)，看不到延滯期，12 h 時(shí)到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)接種于非正常培養(yǎng)環(huán)境中(LB培養(yǎng)基含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%NaCl，5%的橄欖油乳化液，培養(yǎng)溫度55 ℃)時(shí)，如圖5-b所示，3種菌株生長(zhǎng)速度明顯減慢，停滯期延長(zhǎng)接近20 h，到60 h時(shí)才進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此時(shí)菌體濃度YB4-1>YB4-2>YB1，均低于正常LB液體環(huán)境中的菌體濃度。

2.6 篩選菌株復(fù)合菌劑對(duì)餐廚垃圾降解率的影響

復(fù)合菌劑的制備：將YB1、YB4-1和YB4-2分別在LB液體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaCl，5%的橄欖油乳化液，培養(yǎng)溫度55 ℃)中培養(yǎng)60 h，將發(fā)酵液按體積比1∶1∶1混合制作成復(fù)合菌劑。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組接種投料質(zhì)量1%的復(fù)合菌劑，對(duì)照組對(duì)應(yīng)添加投料質(zhì)量1%的空白培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)按照1.2.6中堆肥方法進(jìn)行高溫好氧堆肥，通過(guò)稱(chēng)重系統(tǒng)記錄整個(gè)堆肥過(guò)程中重量變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 堆肥過(guò)程中減重
Fig.6 Weight loss during composting

圖6顯示了復(fù)合菌劑在堆肥過(guò)程中對(duì)餐廚垃圾降解率的影響，開(kāi)始出現(xiàn)的減重主要是因?yàn)樗终舭l(fā)的緣故，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組接種復(fù)合菌劑后第2天開(kāi)始，餐廚垃圾減重明顯升高，第4天達(dá)到最高值，單日減重2.8 kg，后期隨著有機(jī)質(zhì)的不斷分解利用，減重逐漸降低，15 d后趨于穩(wěn)定，總減重率可達(dá)到85%。對(duì)照組在第4天減重開(kāi)始上升，第8天減重達(dá)到最大值，單日最高減重明顯低于實(shí)驗(yàn)組，25 d后趨于穩(wěn)定，總減重率接近65%。由此可知，該復(fù)合菌劑不僅能明顯縮短堆肥周期(約40%)，而且將餐廚垃圾降解率提高了31%，非常適合作為餐廚垃圾降解菌。

2.7 篩選菌株在高溫好氧堆肥過(guò)程水解酶酶活

在2.6中實(shí)驗(yàn)組堆肥過(guò)程的第2、4、6、8、10、12天時(shí)分別取樣測(cè)定餐廚垃圾高溫好氧堆肥過(guò)程中的水解酶酶活，測(cè)定結(jié)果如圖7所示。

測(cè)定結(jié)果表明，4種水解酶酶活力在堆肥開(kāi)始的第2天都能檢測(cè)到；淀粉酶和脂肪酶酶活在第4天均達(dá)到最大值，分別為130.0和5.2 U/mL；蛋白酶和纖維素酶酶活分別在第6天和第8天達(dá)到最大值，分別為13.0和2.5 U/mL，這可能與產(chǎn)酶微生物不同的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。4種酶的酶活在達(dá)到最高值后均有減弱趨勢(shì)，可能因?yàn)殡S著有機(jī)質(zhì)的分解整個(gè)堆肥環(huán)境發(fā)生了變化，影響了酶的活力。

a-淀粉酶酶活；b-蛋白酶酶活；c-脂肪酶酶活；d-纖維素酶酶活
圖7 堆肥過(guò)程中的酶活
Fig.7 Enzyme activity during composting

3 結(jié)論

本研究從不同環(huán)境中腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥樣品中進(jìn)行芽孢桿菌菌種篩選，通過(guò)富集、分離純化獲得了8株形態(tài)各異的目標(biāo)菌株，分別編號(hào)為YB1、YB2、YB3-1、YB3-2、YB4-1、YB4-2、YB4-3和YB5，經(jīng)菌落顯微染色觀(guān)察，所有菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，且內(nèi)部有芽孢。

通過(guò)平板透明圈法測(cè)定各菌株的產(chǎn)酶能力，結(jié)果顯示8株菌均有分解淀粉的能力，7株菌(除YB3-2外)均有分解纖維素的能力，6株菌(除YB2和YB5外)均有分解蛋白質(zhì)的能力，只有3株菌具有分解油脂的能力，其中YB1、YB4-1和YB4-2對(duì)淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)及油脂具有更強(qiáng)的分解能力。耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明，除YB5外，其余菌株均能在55 ℃及7%的鹽度下快速生長(zhǎng)，具有較高的溫度和鹽度耐受性。綜合考慮各菌株的產(chǎn)酶能力及對(duì)溫度和鹽度的耐受性，最終確定YB1、YB4-1和YB4-2為潛力菌株，用于后續(xù)堆肥實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定，確定YB1、YB4-1和YB4-2分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

將3株菌株等比例制作成復(fù)合菌劑用于餐廚垃圾堆肥實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明從第2天開(kāi)始，餐廚垃圾減重明顯升高，第4天達(dá)到最高值，15 d后趨于穩(wěn)定，總減重率可達(dá)到85%，該復(fù)合菌劑不僅能明顯縮短堆肥周期(約40%)，而且將餐廚垃圾降解率提高了31%，非常適合作為餐廚垃圾降解菌。