蘋果矮化砧木組織培養(yǎng)的主要影響因素和問題分析

黃立華

摘要 ? ?本文以蘋果矮化砧木為對象，簡要綜述了其研究進(jìn)展和在組織培養(yǎng)過程中的主要影響因素，并對組織培養(yǎng)過程中存在的問題進(jìn)行了闡述，以期為蘋果矮化砧木快繁提供借鑒。

關(guān)鍵詞 ? ?蘋果矮化砧木;組培快繁;影響因素;問題

中圖分類號 ? ?S661.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）12-0114-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

蘋果矮化密植栽植已成為當(dāng)今世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展和研究的主流，而其主要方式是利用矮化砧木[1-3]。當(dāng)前生產(chǎn)上主要有矮化中間砧和自根砧2種類型，通過對比發(fā)現(xiàn)，后者擁有整齊度高、早果性、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等諸多優(yōu)勢[2];生產(chǎn)上后者的繁殖方式主要有壓條、扦插和組織培養(yǎng)等3種，與前2種繁殖方式對比發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)擁有繁殖系數(shù)大、周期較短、不受季節(jié)約束、苗整齊度高以及節(jié)省育苗用地等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。因此，本文以矮化蘋果自根砧為研究對象，介紹其組織培養(yǎng)研究進(jìn)展，以及主要影響因素和培養(yǎng)過程中存在的問題，以期為生產(chǎn)上蘋果矮化自根砧的快繁提供理論依據(jù)。

1 ? ?蘋果矮化自根砧的組培研究進(jìn)展

在20世紀(jì)60年代，研究者通過矮化自根砧的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到了其再生植株，在20世紀(jì)80年代，組織培養(yǎng)在蘋果砧木快繁上得到了較快的發(fā)展[4-5]。

我國蘋果砧木組培快繁的研究工作起源于20世紀(jì)70年代，于1977年通過利用M7和M9 2種蘋果砧木的新梢作為研究材料，對枝段的莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，突破性地獲得了移栽的組培苗[3-5];而快速發(fā)展階段是在80年代中后期[5-6];目前，多數(shù)品種和砧木的器官已經(jīng)能夠進(jìn)行工廠化育苗。蘋果矮化自根砧繁殖主要采用組織培養(yǎng)快速繁殖，雖然此種方式對技術(shù)要求較高，但其諸多優(yōu)點(diǎn)使其在蘋果矮化自根砧的快速返回和無病毒苗培育上有較為廣泛的應(yīng)用[3-5]。

2 ? ?蘋果矮化自根砧組培的主要影響因素

2.1 ? ?基因型

基因型不同是較主要的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，相同品種在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最終表現(xiàn)不同;不同品種在相同培養(yǎng)條件下表現(xiàn)也不同。因此，需要對不同蘋果砧木類型的組培快繁進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究[7]。通過對奧查金、美鈴、新紅星蘋果進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其生長分化的情況有顯著差異，首先從分化指數(shù)可以看出差別;此外，瓶內(nèi)材料的長勢情況差異較大，從優(yōu)到差依次為奧查金>美鈴>新紅星[8]。

2.2 ? ?基本培養(yǎng)基

研究表明，MS培養(yǎng)基（附加瓊脂+蔗糖，濃度分別為6 g/L和30 g/L）為較多蘋果砧木組織培養(yǎng)常用的基質(zhì)[4];另外有研究發(fā)現(xiàn)，GM256和M26砧木材料在增殖生長過程中，最佳的基質(zhì)為QL[9-10];師校欣等發(fā)現(xiàn)，首紅試管苗采用的是改良的C17作為基本培養(yǎng)基[11]。

2.3 ? ?植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑主要有細(xì)胞分裂素、生長素和赤霉素等[4，12]，其中細(xì)胞分裂素和生長素是在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)和繼代過程中發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)劑[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素是在細(xì)胞分裂、不定芽分化和莖的分化等過程中起作用的[12-13]，而當(dāng)培養(yǎng)基中添加此種調(diào)節(jié)劑，可以起到推動細(xì)胞的分裂、器官或愈傷組織可以產(chǎn)生不定芽[12];此外，此種調(diào)節(jié)劑還能夠抑制頂端優(yōu)勢，從而使腋芽萌發(fā)，因而也可以用于增殖[12];在蘋果矮化砧木組織培養(yǎng)進(jìn)程中用到的此類調(diào)節(jié)劑常常有玉米素、6-芐基腺嘌呤和激動素（分別為ZT、6-BA和KT）等一類嘌呤的衍生物[12-13]。

生長素在蘋果矮化砧木組織培養(yǎng)過程中的功能是促使外植體進(jìn)行脫分化以及促進(jìn)細(xì)胞開始分裂生長，另外還起到對根的分化進(jìn)行誘導(dǎo)的功能[4]。研究和生產(chǎn)上經(jīng)常使用的此類調(diào)節(jié)劑有IBA、NAA、IAA，它們的活性強(qiáng)弱順序?yàn)镹AA>IBA>IAA[12]。

研究表明，在蘋果矮化砧木離體的莖尖頂端分生組織中，生長激素不能自我產(chǎn)生，需人為提供細(xì)胞分裂素和生長素，其主要作用是促使莖尖的生長分化[14]。研究發(fā)現(xiàn)，2種激素對細(xì)胞生長分化具有協(xié)同作用，其不同配比和不同量對細(xì)胞分化產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用不同[14]。另外，繼代培養(yǎng)成功的重要因素是激素的類型和質(zhì)量濃度[7];研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)劑的種類、濃度以及不同的組合能夠使組織、器官的發(fā)育和分化方向有差異[15]。前人研究發(fā)現(xiàn)，蘋果矮化砧木使芽分化誘導(dǎo)的最佳調(diào)節(jié)劑為6-BA，濃度為0.5～2.0 mg/L;繼代和增殖培養(yǎng)時，最佳的調(diào)節(jié)劑為6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L;生根培養(yǎng)時，最佳調(diào)節(jié)劑為IAA 1.0～1.5 mg/L [16-17]。此外，對蘋果砧木組培快繁研究發(fā)現(xiàn)，品種和研究者的不同導(dǎo)致激素類型和濃度有所差異，對于相同的蘋果砧木而言，研究者的不同使研究的結(jié)論也不盡相同[9，12，18-22]。

2.4 ? ?培養(yǎng)條件

在蘋果矮化砧木組培快繁中，培養(yǎng)條件的影響因素有多種，其中主要影響因素為光照和溫濕度[4，12，23]。研究發(fā)現(xiàn)，通常情況下，培養(yǎng)室的光照時間、光照強(qiáng)度分別為12～16 h/d、1 000～5 000 lx[4，23];另外，黑暗條件可以使細(xì)胞和愈傷組織的增殖效果顯著，但器官分化則需要適宜的光照[12，23]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫濕度過高和過低時，都不利于植物的生長，在蘋果矮化砧木組培快繁中要求的溫度為25 ℃左右，濕度保持為70%～80%[4-5]。此外，高溫高濕可能導(dǎo)致試管苗玻璃化[4]。

3 ? ?褐化及玻璃化問題

3.1 ? ?褐化問題

蘋果矮化自根砧外植體褐化是影響其組培快繁的主要因素，組培一般采用HgCl2和乙醇配合的方法滅菌，以達(dá)到無菌的狀態(tài)，在此過程中易出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象[4-5]。

研究表明，褐化的產(chǎn)生與品種、取材時間、消毒時間、激素水平、取材部位、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件以及外植體的年齡和大小等都有一定關(guān)系[4，12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，基因型是褐變產(chǎn)生的最關(guān)鍵原因[4];木本植物體內(nèi)酚類物質(zhì)處于高水平時，褐化幾率較大;外植體樹齡大，其木質(zhì)素含量高，易褐化;外植體較小時，也易褐化[12];此外，處于生長季節(jié)的外植體中含有較多的多酚氧化物，也較易發(fā)生褐化[4]。木質(zhì)化程度和代謝活動不同的外植體，其褐化程度也不同;高溫、高濃度的細(xì)胞分裂素或無機(jī)鹽也易導(dǎo)致褐化[4，24]。

因?yàn)楹只瘜μO果矮化砧木組培快繁影響較大，所以相應(yīng)的防止研究較多。研究表明，低溫可以抑制酚類物質(zhì)氧化，從而降低多酚氧化酶活性，進(jìn)而降低外植體的褐化率[4-5];梁海永等對阿月渾子采用暗培養(yǎng)后光培養(yǎng)以減輕褐化[25];選擇適宜的取材時間[4]、取材部位[26]及取較大外植體[24]也有利于抑制褐化。研究發(fā)現(xiàn)，核桃在春秋季取材較夏季取材褐化減輕[24];10年以上成年樹側(cè)芽易發(fā)生褐化，而1～3年實(shí)生苗則褐化發(fā)生較遲[26];加入Na2S2O3的培養(yǎng)基能夠減少核桃外植體產(chǎn)生褐化現(xiàn)象[27]。此外，添加褐化抑制劑（如抗壞血酸、半胱甘肽、乙二酸四乙酸等[26]）或吸附劑（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）能夠抑制酚類進(jìn)行氧化，進(jìn)而減輕褐化的產(chǎn)生[26]。

3.2 ? ?玻璃化

此種問題的蘋果矮化砧木組培苗呈現(xiàn)的形態(tài)是半透明狀和外觀異常[4-5]，表現(xiàn)為葉片皺縮和卷曲、脆弱易破碎、顏色不正、分化能力低、移栽成活率低等[3-5]。因此，蘋果矮化自根砧組培中的玻璃化現(xiàn)象為其快繁過程中的又一難題。

導(dǎo)致蘋果矮化自根砧組培苗玻璃化的原因有很多，其中基因型是導(dǎo)致其發(fā)生的主要原因;其次直接導(dǎo)致其發(fā)生的原因有環(huán)境濕度、外植體的類型和高的培養(yǎng)基水勢;再有能夠?qū)е缕浒l(fā)生的原因有培養(yǎng)基中不適宜的碳源、無機(jī)鹽或離子;還有就是6-BA可以致使玻璃化的產(chǎn)生[2-4]，通過對M7蘋果砧木和富士蘋果研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中6-芐基腺嘌呤濃度高則玻璃化率就高，當(dāng)濃度為0.5 mg/L和1.5 mg/L時，所發(fā)生的比例分別為10%和50%[28];此外，培養(yǎng)條件的不適合，也是產(chǎn)生玻璃化苗的原因[3-5]。

對于組培快繁中防止玻璃化的產(chǎn)生，也有較深的研究。當(dāng)外植體類型選擇合適時，玻璃化率就會大幅降低，通過對瑞香不同外植體類型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中部莖段玻璃化率高達(dá)100%，而其基部和莖尖則較低[29]。調(diào)整培養(yǎng)基中碳源、無機(jī)鹽或離子也能夠在一定程度上使玻璃化的發(fā)生幾率降低。張翠玉等[30]對月季玻璃化率研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少或減少硝酸銨時，其發(fā)生率顯著降低;當(dāng)鹽的濃度適宜時，能夠使玻璃化的產(chǎn)生幾率降低;另外，K+或Ca2+也能夠降低玻璃化的發(fā)生幾率[31]。針對植物生長調(diào)節(jié)劑尤其是6-BA易導(dǎo)致玻璃化發(fā)生的原因，研究發(fā)現(xiàn)，可降低其濃度來防止或減輕玻璃化的產(chǎn)生[28]。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瓊脂的濃度提高時，玻璃化的產(chǎn)生幾率也會降低[32];水分脅迫劑（PVA）的加入也能夠使玻璃化的產(chǎn)生幾率降低[28]。

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