冬瓜多糖的提取及其生物活性的研究

詹亦貝，周楷旋，汪銘軒，胡 菲

(湖北理工學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435003)

隨著科學(xué)技術(shù)的進步與發(fā)展，國內(nèi)外大量的科研人員對多糖這類生物活性物質(zhì)進行了提取、分離純化、生物活性及作用機理等各方面的研究，證實了其具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抑菌性[4]、降血脂[5]、護肝[6]等多方面生理功能。植物多糖對于人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基具有很好的清除效力，并且可通過改變細(xì)胞膜、壁的結(jié)構(gòu)和功能，抑制微生物的生長[4]。另外，研究表明抗腫瘤藥物一般是直接殺死細(xì)胞，而多糖對于正常細(xì)胞表現(xiàn)出無毒性，香菇多糖通過影響一些關(guān)鍵酶的活性或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而加強化療藥對腫瘤的作用[7]。

冬瓜屬葫蘆科，一年生草本，是傳統(tǒng)食品，因其外觀和顏色，又被稱之為白瓜、枕瓜等。冬瓜原產(chǎn)于中國，全國各地均有種植，屬于生活中常見蔬菜之一，其顯著特點是產(chǎn)量高、無脂、低鈉、碳水化合物含量高；具有清熱利水、消腫之功效，對動脈硬化、水腫膨脹、肝硬化、肝腹水、冠心病、高血壓、腎炎，甚至是糖尿病等慢性疾病，都有相對良好的治療作用[8-9]?？傊?，冬瓜是價廉物美的蔬菜，同時也是功能食品原料。目前對冬瓜水溶性多糖的研究報道較少。鑒于多糖具有許多生理功能，本文以水作為提取劑來提取冬瓜多糖并優(yōu)化提取工藝，探索了冬瓜多糖的抗氧化性和抑菌性，為冬瓜多糖在食品和醫(yī)藥等行業(yè)的開發(fā)與利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

材料：本地市售冬瓜；供試菌：大腸桿菌；枯草芽孢桿菌；金黃色葡萄球菌；酵母；黑曲霉；葡萄糖；苯酚；胰蛋白胨酵母提取物；三羥甲基氨基甲烷(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平，奧豪斯儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵，鞏義予華儀器有限公司；BC-R203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；H1850離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV1800紫外分光光度計，日本島津公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；KYC-1112恒溫培養(yǎng)搖床，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1冬瓜預(yù)處理

取市售的新鮮冬瓜，洗凈，去1～2 mm皮，棄瓜瓤，乙醇浸洗5 min，切塊，-20 ℃冰凍過夜，研磨成泥狀。

1.3.2冬瓜多糖的提取及其工藝優(yōu)化

本試驗用水作為提取劑提取冬瓜多糖并用乙醇沉淀，首先利用單因素試驗法分別研究提取溫度、提取時間和料液比3種因素對冬瓜多糖提取率的影響，然后根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取提取時間、提取溫度和料液比進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗[10-11]，對提取冬瓜多糖的這3種因素進行工藝優(yōu)化，最終確定冬瓜多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.3Sevag法純化多糖

采用Savag法去除冬瓜粗多糖中的蛋白[12]，配制氯仿-正丁醇(5∶1體積比)的Sevag試劑，冬瓜粗多糖溶液與Sevag試劑按5∶1比例混合，室溫充分振搖30 min，離心取上清液；用此方法將上清液再處理5～6次直至無蛋白乳化層，純化后的冬瓜多糖使用乙醇沉淀再低溫烘干備用。

1.3.4冬瓜多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[13]利用紫外分光光度計測定冬瓜多糖的吸光度，以葡萄糖的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以溶液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：y=9.62522x+0.0513，相關(guān)系數(shù)R2=0.9927，按照回歸方程計算多糖的含量。

1.3.5抗氧化性試驗

1.3.5.1羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定參考Lu等[14-15]的方法，并有所改動。體系內(nèi)經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)，得到復(fù)合物在510 nm處有強烈吸收峰。反應(yīng)體系：1.0 mL的10 mM的水楊酸乙醇溶液和1.0 mL的冬瓜多糖溶液，混合均勻后，加入1.0 mL的FeSO4(10 mM)溶液，震蕩1～2 min，再加入4 mL的300 μM的H2O2，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，在510 nm下測其吸光度A1；A0為不加冬瓜多糖的吸光度；A2為H2O2溶液改用H2O并加入冬瓜多糖的吸光度。由于維生素C(Vc)具有良好的抗氧化性，因此選用Vc作陽性對照。

(1)

1.3.5.2DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定參考Blois等[15-16]的方法，并加以改動。體系內(nèi)經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)，得到復(fù)合物在517 nm處有強烈吸收峰。反應(yīng)體系：2 mL冬瓜多糖溶液和去離子水3.6 mL，再加入0.4 mL的DPPH自由基的乙醇溶液(0.4 mM)，震蕩數(shù)分鐘，25 ℃水浴30 min。取出后在517 nm下測其吸光度A3；A4為DPPH自由基改用乙醇并加入冬瓜多糖的吸光度；A0為不加冬瓜多糖的吸光度，并用Vc作陽性對照。

(2)

1.3.6抑菌性試驗

1.3.6.1供試菌種的活化及菌液的制備

預(yù)先將5種供試菌種接入LB液體培養(yǎng)基(約1%的含菌量)，置于適宜條件下活化過夜，加入生理鹽水稀釋10～100倍，搖勻后，制得濃度為106～108CFU/mL的菌液，備用。

1.3.6.2冬瓜多糖抑菌能力測定

采用瓊脂擴散濾紙片法和光電比濁法[17-18]測定冬瓜多糖的抑菌能力，將定性濾紙加工裁剪成15 mm左右的圓形濾紙片，滅菌，置于不同濃度的冬瓜多糖溶液中浸泡20 min，自然晾干，備用。倒入固體培養(yǎng)基，待固體培養(yǎng)基冷卻凝固后，分別加入100 μL菌液，涂布均勻，室溫下，靜置生長15 min，水平貼上已處理的濾紙片，濾紙片間隔1 cm左右，并以浸泡過滅菌水的濾紙片作為對照，測其抑菌圈的直徑。

取3個150 mL的錐形瓶分別加入39 mL已滅菌的通用液體培養(yǎng)基，待冷卻后再分別加入10 mL生理鹽水和已滅菌的冬瓜多糖溶液(50 mg/mL)，然后將配置好的金黃色葡萄球菌懸液分別取1 mL加入這3個錐形瓶。在接下來的28 h內(nèi)，共取樣液18次。每次取完樣液點后重新將錐形瓶放回恒溫?fù)u床上振蕩，立刻測其吸光度，繪制其生長曲線。

2 結(jié)果討論

2.1 單因素試驗

2.1.1提取溫度對冬瓜多糖提取率的影響

提取溫度對冬瓜多糖提取率的影響如圖1所示。當(dāng)提取溫度為70 ℃時，冬瓜多糖的提取率為0.65%；隨著溫度的升高，冬瓜多糖的提取率也逐漸升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到90 ℃時，提取率達(dá)到最大值0.854%；當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時，提取率有所下降。這可能是由于溫度過高，破壞了冬瓜多糖的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分冬瓜多糖分解，因此其提取率有所下降。

圖1 提取溫度對冬瓜多糖提取率的影響

2.1.2提取時間對冬瓜多糖提取率的影響

提取時間對冬瓜多糖提取率的影響如圖2所示。當(dāng)提取時間為1.5 h時，冬瓜多糖的提取率為0.63%；隨著時間的增加，冬瓜多糖的提取率也逐漸升高，當(dāng)提取時間達(dá)到2 h，冬瓜多糖的提取率達(dá)到最大值0.754%；當(dāng)時間達(dá)到2.5 h，多糖提取率下降至0.74%；當(dāng)時間達(dá)到3 h，提取率繼續(xù)下降。試驗結(jié)果顯示，提取時間在2 h時冬瓜多糖的提取率達(dá)到最高，長時間的加熱可能會使多糖的部分鏈斷裂，從而使多糖鏈變短導(dǎo)致后續(xù)用乙醇沉淀出來的多糖變少，最終導(dǎo)致提取率降低。

圖2 提取時間對冬瓜多糖提取率的影響

2.1.3料液比對冬瓜多糖提取率的影響

料液比對冬瓜多糖提取率的影響如圖3所示。當(dāng)料液比為5∶1時，冬瓜多糖的提取率為0.67%；當(dāng)料液比為2∶1時，冬瓜多糖提取率達(dá)到最大值0.851%；當(dāng)料液比為1∶1時，冬瓜多糖提取率下降至0.78%。這可能是提取劑的用量改變了胞內(nèi)外的濃度差，促進胞內(nèi)多糖擴散，然而冬瓜原材料本身含有大量的水，所以提取最適的料液比為2∶1。

圖3 料液比對冬瓜多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.2.1冬瓜多糖提取試驗方案和因素水平

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)這3個因素，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計法。響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.2.2響應(yīng)面分析

以提取溫度、料液比、提取時間為變量，以冬瓜多糖提取率為響應(yīng)值，以-1，0，1分別代表變量的水平，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件進行多元線性回歸分析，得回歸方程：

Y=-9.3208+0.9A+0.20853B+0.2731C-2.4822×10-3AB+0.0327AC-9×10-5BC-0.10851A2-1.17471×10-3B2-0.08396C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3。多元回歸方程中各提取因素(自變量)對冬瓜多糖提取率(響應(yīng)值)影響的顯著性是由P值來判定，一次項B和二次項C2是顯著，二次項A2是極其顯著，各提取因素對冬瓜多糖提取率的影響是多元線性關(guān)系而并非簡單的線性關(guān)系。根據(jù)F值的大小推斷，3個提取因素對冬瓜多糖提取率的影響排序為：提取溫度(B)>料液比(C)>提取時間(A)。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計方案，所得試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析計算，不同提取因素對冬瓜多糖提取率的影響如圖4所示。通過對回歸方程求導(dǎo)和用Design Expert 8.0.6軟件進行分析計算，最終確定冬瓜多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間2.23 h、提取溫度86.32 ℃、提取料液比2.05∶1，在該條件下冬瓜多糖的提取率為0.959 2%。按最佳提取工藝提取多糖，3次平行組試驗的結(jié)果表明最佳提取率平均值為0.963 3%，與響應(yīng)面分析預(yù)測值接近，即該方程與實際情況擬合較好，因此響應(yīng)面法適用于冬瓜多糖的提取工藝優(yōu)化。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果

注：*P<0.05，差異顯著；**P<0.01，差異極顯著。

(a) 提取時間和提取溫度 (b) 提取時間和料液比 (c) 提取溫度和料液比

2.3 冬瓜多糖的生物活性研究

2.3.1冬瓜多糖的抗氧化性研究

按照1.3.5.1的方法測定冬瓜多糖和Vc對羥基自由基的清除效果如圖5所示。冬瓜多糖對羥基自由基的清除效果沒有Vc顯著，IC50(半數(shù)清除率)為0.913 mg/mL，比Vc的0.401 mg/mL要高。

圖5 冬瓜多糖和Vc對羥基自由基的清除效果

冬瓜多糖和Vc對DPPH自由基的清除效果如圖6所示。冬瓜多糖對DPPH自由基的清除效果優(yōu)于Vc，其IC50為0.221 mg/mL。

圖6 冬瓜多糖和Vc對DPPH自由基的清除效果

2.3.2冬瓜多糖的抑菌性研究

2.3.2.1冬瓜多糖對5種供試菌的抑菌效果

15 mg/mL的冬瓜多糖對5種供試菌種的抑菌圈直徑見表4。冬瓜多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳，在15 mg/mL時其抑菌圈直徑可達(dá)到1.83 cm；對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果則次之，相對于黑曲霉和酵母則不表現(xiàn)抑菌性。

表4 冬瓜多糖對5種供試菌種的抑菌圈直徑 cm

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗的平均值；“-”表示沒有抑菌圈。

2.3.2.2冬瓜多糖對細(xì)菌生長的影響

采用光電比濁法動態(tài)測定冬瓜多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的影響。對照組為未添加冬瓜多糖的生理鹽水。冬瓜多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的影響分別如圖7、圖8所示。由圖7和圖8可見，冬瓜多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均有較強的抑制作用。

圖7 冬瓜多糖對大腸桿菌生長的影響

圖8 冬瓜多糖對金黃色葡萄球菌生長的影響

2.3.2.3冬瓜多糖的最低抑菌濃度

以金黃色葡萄球菌為例，用瓊脂擴散濾紙片法，以抑菌圈直徑為指標(biāo)判定冬瓜多糖樣品的抑菌效果，對每種測試菌作3個平行樣，取平均值。不同濃度的冬瓜多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表5。由表5可看出冬瓜多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果十分明顯，最低抑菌濃度為5 mg/mL。

表5 不同濃度的冬瓜多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗的平均值；“-”表示沒有抑菌圈。

3 結(jié)論與展望

本研究采用水提醇沉法提取冬瓜多糖。為進一步優(yōu)化提取多糖工藝，本試驗探索了提取時間、提取溫度、提取料液比3個因素對冬瓜多糖提取率的影響。通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，冬瓜多糖提取率的影響因素排序為：提取溫度>料液比>提取時間；冬瓜多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間2.23 h、提取溫度86.32 ℃、提取料液比2.05∶1，在該條件下冬瓜多糖的提取率為0.96%。優(yōu)化后的提取工藝省時且節(jié)能，是一種穩(wěn)定可行的良好方法。

冬瓜多糖在體外清除自由基方面顯示較強的能力，冬瓜多糖對羥基自由基具有一定的清除效果，但與Vc的清除效果相比則相對較弱；對DPPH自由基具有很好的清除效果，且清除效果較Vc略強，同時也表明冬瓜多糖對不同的自由基具有不同抗氧化作用效果。多糖在生物體內(nèi)的抗氧化性與在體外的抗氧化性的作用機制是截然不同的，在體內(nèi)的抗氧化作用機制十分復(fù)雜，除了體內(nèi)自由基的猝滅途徑外，還會通過調(diào)節(jié)生物體體內(nèi)抗氧化酶的活性或補充外源性抗氧化劑來參與作用[19]，因此，后續(xù)研究可以進一步探索冬瓜多糖在生物體內(nèi)抗氧化活性及其機理。

多糖對不同微生物的生長有著不同程度的影響，冬瓜多糖濃度為15 mg/mL時對黑曲霉和酵母均無明顯抑制效果，冬瓜多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌都有較強的抑制作用，以金黃色葡萄球菌最為顯著，其最低抑菌濃度(MIC)為5 mg/mL。對冬瓜多糖的其他生物活性如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等還有待進一步研究。本研究為冬瓜多糖在食品和醫(yī)藥等行業(yè)的開發(fā)與利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。