rhPGRN通過(guò)MAPK/PI3K通路調(diào)控自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞增殖*

羅 瑞，秦啟忠，劉 敏，尹丹旸，郭風(fēng)勁

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，發(fā)育生物學(xué)與模式動(dòng)物平臺(tái)，重慶400016）

生長(zhǎng)因子顆粒體蛋白前體（progranulin，PGRN）由GRN基因編碼，是含有593個(gè)氨基酸的分泌性糖蛋白，分泌到細(xì)胞外后以完整形態(tài)或者水解后的組成肽形式發(fā)揮功能[1-2]。研究證實(shí)PGRN與發(fā)育、組織修復(fù)再生、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和炎癥密切相關(guān)，并且能調(diào)控多種溶酶體酶活性[3-4]。PGRN在神經(jīng)元和免疫細(xì)胞中大量表達(dá)，并且在乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、骨肉瘤、阿爾茨海默病和其它神經(jīng)退行性疾病中表達(dá)顯著增高[1-2，5]。GRN基因的突變涉及了很多常見的疾病包括額顳葉癡呆和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉著癥，目前PGRN作為一種生長(zhǎng)因子被證實(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和溶酶體貯積病具有治療作用[3]。文獻(xiàn)報(bào)道[2，6-7]，通過(guò)重組PGRN或其衍生的工程化蛋白Atsttrin的局部遞送可以在手術(shù)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）模型中有效抑制炎癥，減少軟骨基質(zhì)的降解，減緩OA樣表型的進(jìn)一步發(fā)展，并且在非手術(shù)誘導(dǎo)的大鼠中表現(xiàn)出對(duì)OA的預(yù)防效果。已有實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pHis/Myc-PGRN質(zhì)粒的穩(wěn)定293細(xì)胞株，細(xì)胞增殖速度顯著增加[8]。同時(shí)，PGRN還可以通過(guò)激活股骨頭壞死患者體內(nèi)軟骨組織分離的軟骨細(xì)胞ERK1/2通路，上調(diào)聚集蛋白聚糖（aggrecan，ACN）和II型膠原（collagen type II，Col II）的表達(dá)，改善軟骨細(xì)胞合成代謝的能力，但具體機(jī)制尚不明確[4，9]。

本研究首先構(gòu)建含有His標(biāo)簽的PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，進(jìn)而利用這一穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株獲得具有生物活性的人源重組蛋白rhPGRN。His標(biāo)簽一般由6～12個(gè)氨基酸殘基組成，作為一種常用的蛋白質(zhì)純化親和標(biāo)簽，在蛋白質(zhì)純化方法中日益受到重視[10-11]。重組蛋白N端組氨酸殘基上的咪唑基團(tuán)能與Ni2+、Co2+和Ca2+等金屬離子形成配位鍵并隨固相載體中的螯合化合物如亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）或氨三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）分離，通過(guò)咪唑溶液競(jìng)爭(zhēng)性洗脫，可以得到約90%或者更高純度的重組蛋白；同時(shí)，His標(biāo)簽可作為重組蛋白的識(shí)別標(biāo)記[11-13]。我們通過(guò)大批量培養(yǎng)這一穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，獲得具有生物活性的重組蛋白，首先通過(guò)BCA方法及Western blot檢測(cè)該重組蛋白的濃度與純度；進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、Western blot和RT-qPCR等方法探討其對(duì)人軟骨細(xì)胞C28I2和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的影響，以期為后續(xù)深入研究PGRN生物學(xué)功能、開發(fā)生物制劑提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞 293-PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和C28I2細(xì)胞均由紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉傳聚教授饋贈(zèng)；RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 Ni-NTA resin beads購(gòu)自Novex；細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自NEST；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自PAN；G418購(gòu)自BioFroxx；青、鏈霉素溶液和BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PGRN抗體購(gòu)自Abcam；ERK、p-ERK、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）-I/-II、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和需肌醇酶 1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）抗體購(gòu)自CST；p-Akt、P62、剪接型X盒 結(jié) 合 蛋 白 1（spliced X-box binding protein 1，XBP1s）和Ki67抗體及ECL超敏化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Affinity；β-actin抗體購(gòu)自ABclonal；羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自博士德生物工程有限公司；U0126、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，Baf-A1）和4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C28I2和RAW264.7細(xì)胞使用含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株加入100 mg/L的篩選抗生素G418，其余培養(yǎng)條件相同。

2.2 rhPGRN重組蛋白的純化與鑒定 PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)至150 mm培養(yǎng)皿，匯合度達(dá)到95%以上后，更換為25 mL無(wú)FBS DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，100×g離心3 min后收集細(xì)胞上清液。取1 mL Ni-NTA resin beads，加入5 mL去離子水，100×g離心3 min棄去上清，重復(fù)3次，同樣條件再使用5 mL Native buffer漂洗2次。每管resin beads加入2 mL DMEM培養(yǎng)液混勻后加入細(xì)胞上清液中，4℃層析柜內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。離心后收集resin beads入離心管內(nèi)，加入20 mL預(yù)冷的Native buffer旋轉(zhuǎn) 5 min，4℃、100×g離心3 min，重復(fù)3次。分別使用6 mL、6 mL、4 mL、4 mL預(yù)冷的Elution buffer進(jìn)行洗脫，4℃旋轉(zhuǎn)8 min，100×g離心3 min，收集4次的濾液使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾至超濾柱內(nèi)。4℃、4 000×g離心8 min，再加入2 mL無(wú)菌PBS，同等條件離心8 min，收集上層液體即為rhPGRN，-80℃保存。用BCA試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot測(cè)定rhPGRN的濃度和純度。

2.3 C28I2和RAW264.7細(xì)胞增殖的變化 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C28I2和RAW264.7細(xì)胞分別以每孔2.5×104和0.5×105的密度接種于24孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入100和200 μg/L rhPGRN，每24 h更換培養(yǎng)液并加入rhPGRN，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后傳代至6孔板。分別在2 d、3 d、4 d、5 d用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)量為計(jì)數(shù)板4個(gè)大格細(xì)胞平均數(shù)×107/L。

2.4 Western blot檢測(cè)增殖、自噬和ERS相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以后，細(xì)胞換用無(wú)FBS培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，使用rhPGRN分別處理0、10、30和120 min后檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)；其余組換用含10%FBS的培養(yǎng)液，使用rhPGRN、3-MA、4-PBA、Baf-A1和U0126分別處理不同組細(xì)胞。各組處理的C28I2和RAW264.7細(xì)胞中加入1 mL RIPA裂解液后收集裂解液超聲破碎，11 500×g離心15 min，收集上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入SDS蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。12%聚丙烯酰胺凝膠中每孔上樣20 μg，120 V恒壓電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜后4℃孵育Ⅰ抗過(guò)夜。TBST洗膜后加入Ⅱ抗常溫孵育120 min，硝酸纖維素膜上滴加超敏ECL發(fā)光液，暗室膠片曝光。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)分子的mRNA表達(dá) C28I2和RAW264.7細(xì)胞鋪皿后待細(xì)胞貼壁，使用rhPGRN單獨(dú)或聯(lián)合U0126處理24和48 h。首先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心后棄去上清，各組細(xì)胞加入1 mL裂解液RL，收集裂解物置于無(wú)酶EP管，4℃、11 500×g離心10 min，上清液中加入0.2 mL三氯甲烷，振蕩15 s，孵育3 min，同樣條件離心。取最上層液體加等體積70%乙醇，混勻后加入吸附柱RA中9 500×g離心45 s，分別用500 μL漂洗液RW、去蛋白R(shí)E、漂洗液RW洗1次。將吸附柱RA放入無(wú)酶EP管中并加入20 μL RNase-free water，11 500×g離心1 min，測(cè)濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共39個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primer for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 rhPGRN的提取與鑒定

通過(guò)Ni-NTA瓊脂糖樹脂親和純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，使用咪唑溶液洗脫后再進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示目的蛋白rhPGRN分子量約為88 kD，與預(yù)期相符，純度大于95%，另有兩次提取的rh-PGRN發(fā)生降解，主要降解片段分子量約為72 kD，見圖1A。通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度并繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.564 4x+0.112 2（R2=0.998 4），測(cè)得rhPGRN濃度約為0.44 g/L和0.23 g/L，見圖1B。Western blot結(jié)果表明，該重組蛋白能與PGRN抗體特異性結(jié)合，降解部分幾乎不能與抗體結(jié)合，見圖1C。

2 rhPGRN促進(jìn)C28I2和RAW264.7細(xì)胞的增殖

在C28I2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rhPGRN（100 μg/L），處理48 h后與對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01）；而RAW264.7細(xì)胞加入rhPGRN（200 μg/L）后24 h即觀察到細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.Identification of rhPGRN purity and concentration.A：Coomassie blue staining results（1～2：different batches of rhPGRN；3～4：degraded rhPGRN；5～7：0.5，0.2 and 0.1 g/L standard protein）；B：protein standard curve；C：Western blot was used to detect the purified rhPGRN（1～3：different batches of rhPGRN）.圖1 rhPGRN的純度及濃度鑒定

Figure 2.Effect of rhPGRN on proliferation of C28I2 and RAW264.7 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

3 rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞周期相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

在C28I2細(xì)胞，rhPGRN處理24 h后，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01），處理48 h后，cyclin B1的mRNA表達(dá)持續(xù)上調(diào)（P＜0.01），而PCNA和cyclin D1的mRNA表達(dá)則較 0 h時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；rhPGRN 處理RAW264.7細(xì)胞24及48 h后，PCNA、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A、B。Western blot結(jié)果顯示，rhPGRN處理C28I2和RAW264.7細(xì)胞24和48 h后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖3C、D。

4 rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

在C28I2細(xì)胞中，rhPGRN處理10 min后p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平均顯著增加，并在rhPGRN處理10 min后達(dá)到峰值（P＜0.01），隨著rhPGRN處理時(shí)間延長(zhǎng)，p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平逐漸降低，p-ERK相對(duì)水平（p-ERK/ERK）在120 min的處理時(shí)間內(nèi)持續(xù)增高（P＜0.01），見圖4A。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)rhPGRN處理30 min后p-Akt、p-ERK和ERK蛋白水平均達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，p-ERK相對(duì)水平在120 min時(shí)達(dá)到峰值（P＜0.01），見圖4B。

5 rhPGRN通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖

進(jìn)一步用ERK通路抑制劑U0126聯(lián)合rhPGRN分別處理C28I2和RAW264.7細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)各項(xiàng)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，C28I2細(xì)胞中，與rhPGRN單獨(dú)處理24 h組相比，U0126+rhPGRN處理24 h后，PCNA、cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平下降（P＜0.05）；與rhPGRN單獨(dú)處理48 h組相比，U0126+rhPGRN處理48 h后，cyclin B1和cyclin D1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平下降（P＜0.05），細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），見圖 5A～C。RAW264.7細(xì)胞中，與rhPGRN單獨(dú)處理24 h組相比，U0126+rhPGRN處理24 h后PCNA、cyclin B1和cyclin D1的 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白水平顯著降低（P＜0.01）；與rhPGRN單獨(dú)處理48 h組相比，U0126+rhPGRN處理48 h后PCNA、cyclin B1和cyclin D1 mRNA水平下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Ki67蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），見圖5D～F。

Figure 3.Effect of rhPGRN on the mRNA and protein expression of cell cycle-related molecules.A：RT-qPCR analysis of the mRNA expression of PCNA，cyclin B1 and cyclin D1 in C28I2 cells treated with 100 μg/L rhPGRN；B：RT-qPCR analysis of the mRNA expression of PCNA，cyclin B1 and cyclin D1 in RAW264.7 cells treated with 200 μg/L rhPGRN；C：the protein level of Ki67 in C28I2 cells was detected by Western blot；D：the protein level of Ki67 in RAW264.7 cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖3 rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞周期相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Effect of rhPGRN on proliferation-related signaling pathways.The protein levels of p-Akt，p-ERK and ERK in rhPGRN-treated C28I2 cells（A）and RAW264.7 cells（B）were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 min group.圖4 rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響

6 rhPGRN誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和ERS依賴于MAPK信號(hào)通路

用U0126聯(lián)合rhPGRN分別處理C28I2和RAW264.7細(xì)胞，并檢測(cè)自噬和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，rhPGRN處理組LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)且P62蛋白水平降低，ERS標(biāo)志蛋白PERK、IRE1和XBP1s表達(dá)上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與rhPGRN單獨(dú)處理組相比，U0126+rhPGRN組LC3-Ⅱ表達(dá)下調(diào)，P62表達(dá)上調(diào)，C28I2細(xì)胞中IRE1和XBP1s表達(dá)下調(diào)，RAW264.7細(xì)胞中PERK、IRE1和XBP1s的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖6。

7 rhPGRN通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬與ERS

進(jìn)一步采用PI3K/Akt通路抑制劑3-MA聯(lián)合rh-PGRN分別處理C28I2和RAW264.7細(xì)胞，并檢測(cè)自噬和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與rhPGRN單獨(dú)處理組相比，3-MA+rhPGRN處理組LC3-Ⅱ表達(dá)下調(diào)，P62表達(dá)上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），C28I2細(xì)胞中XBP1s表達(dá)顯著降低（P＜0.05），RAW264.7細(xì)胞中ERS標(biāo)志蛋白IRE1、XBP1s和PERK的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

8 rhPGRN通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬和ERS促進(jìn)細(xì)胞增殖

采用自噬抑制劑Baf-A1或ERS抑制劑4-PBA與rhPGRN聯(lián)合處理C28I2和RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果顯示，與rhPGRN單獨(dú)處理組相比，Baf-A1+rhPGRN處理組和4-PBA+rhPGRN處理組細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白Ki67表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖8。

討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、OA以及其它關(guān)節(jié)病的滑膜液中均檢測(cè)到了PGRN的水平升高；PGRN被證實(shí)可以通過(guò)拮抗TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)保護(hù)軟骨細(xì)胞的分解代謝，在骨折組織中PGRN依賴TNFR2增強(qiáng)軟骨骨化，發(fā)揮促進(jìn)骨愈合、增強(qiáng)骨再生的作用[6，14]。軟骨細(xì)胞中，PGRN可以通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)和JunB轉(zhuǎn)錄因子控制軟骨形成，此過(guò)程由上游分子BMP2參與調(diào)控，ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)還能激活軟骨細(xì)胞分化[2，4]。PGRN對(duì)炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的募集具有重要作用，可以促進(jìn)炎癥部位中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，其機(jī)制可能是通過(guò)與TNFR1結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)趨化因子水平[15]。目前已經(jīng)開發(fā)了多種PGRN的靶向策略，包括使用胺碘酮促進(jìn)PGRN表達(dá)，通過(guò)真核質(zhì)粒、腺病毒、慢病毒載體過(guò)表達(dá)GRN基因，直接注射或者利用3D打印支架釋放重組蛋白，其中一些方法已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)[16-19]。本研究通過(guò)His標(biāo)簽蛋白純化法提取和純化具有生物活性的人源重組蛋白rhPGRN，并結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志基因的檢測(cè)，觀察到rhPGRN不僅對(duì)人源軟骨細(xì)胞C28I2具有促增殖作用，對(duì)鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7同樣具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，只是在不同類型細(xì)胞中rhPGRN重組蛋白對(duì)增殖相關(guān)標(biāo)志基因時(shí)空表達(dá)譜的影響具有一定差異性。

PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)基本的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞周期；ERK1/2信號(hào)通路同樣參與多種生命過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活、分化、增殖和轉(zhuǎn)錄[20-23]。為了進(jìn)一步研究rhPGRN促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制，接下來(lái)我們探討了rhPGRN是否影響MAPK和PI3K/Akt這兩條參與細(xì)胞增殖的信號(hào)通路。在本研究中，我們觀察到rhPGRN通過(guò)短暫激活ERK和Akt的磷酸化發(fā)揮促增殖作用，并且rhPGRN的這一促增殖作用在加入ERK信號(hào)通路抑制劑U0126后被顯著抑制，說(shuō)明rhPGRN對(duì)C28I2和RAW264.7細(xì)胞的促增殖作用至少部分依賴于MAPK信號(hào)通路。

細(xì)胞自噬和ERS是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞存活的一種機(jī)制，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持，過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)自噬性死亡程序，而過(guò)度ERS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24-25]。我們進(jìn)一步探討rhPGRN是否通過(guò)上述的MAPK/PI3K細(xì)胞增殖信號(hào)通路調(diào)控自噬和ERS。結(jié)果顯示，rhPGRN可以激活自噬和ERS，采用PI3K/Akt通路抑制劑3-MA后，rhPGRN促進(jìn)自噬的作用被抑制，顯示rhPGRN可能通過(guò)PI3K/Akt通路激活細(xì)胞自噬；rhPGRN誘導(dǎo)的自噬和ERS均可被U0126抑制，提示rhPGRN通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬和ERS。最后，我們還觀察到，與rhPGRN組相比，rhPGRN+Baf-A1組和rhPGRN+4-PBA組增殖相關(guān)蛋白Ki67表達(dá)均被抑制。一些相關(guān)研究也報(bào)道了類似的結(jié)果，Chen等[26]的研究觀察到自噬抑制劑氯喹顯著抑制了大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖；Ishimura等[27]通過(guò)ERS抑制劑4-PBA和?；切苋パ跄懰崽幚盹@著抑制了人血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，本研究提示rhPGRN可能通過(guò)MAPK/PI3K信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬和ERS，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Figure 5.Effect of U0126 treatment on rhPGRN-induced cell proliferation.A：RT-qPCR results of different groups of C28I2 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 100 μg/L rhPGRN；B：C28I2 cell counting results of different groups；C：the expression of Ki67 in C28I2 cells was determined by Western blot；D：RT-qPCR results of different groups of RAW264.7 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 200 μg/L rhPGRN；E：RAW264.7 cell counting results of different groups；F：the expression of Ki67 in RAW264.7 cells was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（0 h）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN（24 h）group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs rhPGRN（48 h）group.圖5 U0126處理對(duì)rhPGRN誘導(dǎo)的C28I2和RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

Figure 6.Effect of U0126 treatment on rhPGRN-induced autophagy and ERS.A：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in C28I2 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 100 μg/L rhPGRN were detected by Western blot；B：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in RAW264.7 cells treated with 10 μmol/L U0126 and 200 μg/L rhPGRN were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs rhPGRN group.圖6 U0126處理對(duì)rhPGRN誘導(dǎo)的C28I2和RAW264.7細(xì)胞自噬和ERS的影響

Figure 7.Effects of 3-MA on rhPGRN-induced autophagy and ERS.A：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in C28I2 cells treated with 5 μmol/L 3-MA and 100 μg/L rhPGRN were detected by Western blot；B：the levels of autophagy-and ERS-related proteins in RAW264.7 cells treated with 5 μmol/L 3-MA and 200 μg/L rhPGRN were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN group.圖7 3-MA對(duì)rhPGRN誘導(dǎo)的C28I2和RAW264.7細(xì)胞自噬和ERS的影響

Figure 8.Effect of Baf-A1 and 4-PBA treatment on rhPGRN-induced proliferation of C28I2 cells（A）and RAW264.7 cells（B）.The effects of 0.5 μmol/L Baf-A1 and 5 mmol/L 4-PBA on Ki67 expression were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs rhPGRN group.圖8 Baf-A1和4-PBA處理對(duì)rhPGRN誘導(dǎo)的C28I2和RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

最近的研究還報(bào)道了PGRN通過(guò)PI3K/Akt途徑促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖[28]；通過(guò)TNFR2/Akt和ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[29]；在人胃上皮細(xì)胞和人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中也被證實(shí)具有促增殖作用[30-31]；GRN基因的特異性沉默抑制了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及遷移能力[32]；在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，PGRN被證實(shí)通過(guò)Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制炎癥并促進(jìn)細(xì)胞自噬[33]；在脂肪細(xì)胞中，PGRN可以通過(guò)激活ERS引起自噬增加，引發(fā)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，在肝臟細(xì)胞中也觀察到自噬和ERS的緊密聯(lián)系[34-35]。本研究通過(guò)培養(yǎng)PGRN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株獲得了活性rhPGRN蛋白，作用于兩種不同類型的細(xì)胞驗(yàn)證其促增殖、自噬和ERS的生物學(xué)功能，并探討了這些效應(yīng)與MAPK/PI3K通路的關(guān)系。

綜上所述，本研究成功提取出較高純度的人源重組蛋白rhPGRN，并證實(shí)rhPGRN通過(guò)MAPK/PI3K信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬和ERS，促進(jìn)C28I2和RAW264.7兩種不同類型細(xì)胞的增殖，為后續(xù)rhPGRN相關(guān)藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。