解郁丸對WKY抑郁樣大鼠前額葉皮層與海馬樹突棘的影響*

劉紅梅，李 琦，宋 苗，張 宇，徐 勇△

（山西醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科，山西太原030001）

抑郁癥具有高患病率、高致殘率、高自殺率及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了人類的身心健康[1]。目前，抑郁癥的治療手段甚多，但都沒有得到滿意的療效。復(fù)方中藥解郁丸（Jieyuwan，JYW）由十多種成分組成，副作用較少，研究表明此藥可以影響海馬與前額葉皮層中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)量，其抗抑郁機(jī)制與突觸可塑性存在密切關(guān)系[2]。樹突棘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的原始位點(diǎn)[3]，是接受信息、形成突觸聯(lián)系的重要部位，被認(rèn)為是腦功能可塑性的基礎(chǔ)。樹突棘在數(shù)量和形態(tài)上都具有易變性，所以常導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病理性的改變而引發(fā)各類疾病的發(fā)生，但在抑郁癥中樹突棘結(jié)構(gòu)改變的相關(guān)報(bào)道尚少。

突觸后致密區(qū)蛋白95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）是突觸后膜致密區(qū)的一種支架蛋白，存在于興奮性谷氨酸能突觸內(nèi)[4]，在樹突棘中位于其頭部，參與興奮性突觸傳遞的功能調(diào)控[5]。在抑郁癥中PSD-95蛋白的表達(dá)水平與樹突棘的病理變化是否一致，目前報(bào)道很少。

由此，本研究選用Wistar-koyoto（WKY）抑郁模型大鼠研究前額葉皮質(zhì)與海馬組織中樹突棘的病理變化及PSD-95蛋白的表達(dá)情況，并觀察中藥解郁丸的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

以45只成年雄性WKY大鼠（體重約250～280 g）為研究對象，選取同品系SPF級Wistar大鼠15只作為空白對照（Wistar）組，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)SPF級動物中心，每個(gè)籠子3只，設(shè)施維持在12 h亮/暗循環(huán)、溫度（22±2）℃、濕度50%～60%的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)期間除行為學(xué)測試外動物可以自由獲得食物和水。

2 方法

2.1 動物分組與藥物處理 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將Wistar大鼠（Wistar組）與WKY大鼠（WKY組）進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，以作為基線；然后將45只WKY大鼠隨機(jī)分為模型（WKY+NaCl）組、解郁丸（WKY+JYW）組和西酞普蘭（WKY+citalopram，WKY+CPM）組，每組15只，以15只Wistar大鼠為對照（Wistrar+NaCl）組。各組的給藥處理方式如下：（1）對照組：Wistar大鼠予以生理鹽水灌胃21 d；（2）模型組：WKY大鼠予以生理鹽水灌胃21 d；（3）解郁丸組：將解郁丸（212 mg/kg，河南泰豐制藥股份有限公司）根據(jù)文獻(xiàn)[6]用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備混懸液，灌胃21 d；（4）西酞普蘭組：基于前人實(shí)驗(yàn)[7]將氫溴酸西酞普蘭（10 mg/kg，丹麥靈北藥廠）溶于生理鹽水，灌胃21 d。

2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 用糖水偏好實(shí)驗(yàn)對抑郁大鼠快感缺失行為進(jìn)行檢測。將大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)于一個(gè)籠子并自由飲食，實(shí)驗(yàn)第1天適應(yīng)雙瓶飲水，第2天換成含1%蔗糖的雙瓶飲用1天，第3天放置相等重量的雙瓶（一瓶為純水，一瓶為1%的蔗糖水）進(jìn)行測試，測試時(shí)間為9：00～15：00，期間每3 h交換一次位置，防止產(chǎn)生位置偏愛，測試結(jié)束后稱量兩只水瓶剩余量，計(jì)算糖水偏好程度。糖水偏好系數(shù)（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

2.3 曠場實(shí)驗(yàn) 用曠場實(shí)驗(yàn)檢測抑郁大鼠在空曠空間的探索行為。大鼠被放置于裝有攝像機(jī)的自發(fā)活動箱（100 cm×100 cm×50 cm），設(shè)定中央?yún)^(qū)和外周區(qū)。將每只大鼠輕輕放在活動箱中央開始實(shí)驗(yàn)，視頻記錄5 min。在每只大鼠測試之間，清理干凈活動箱并使用75%乙醇去除氣味。記錄大鼠在空曠空間活動的總距離以及在中央?yún)^(qū)的探索總時(shí)間。

2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測抑郁大鼠的絕望行為。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)設(shè)備為直徑200 mm、高400 mm的裝有攝像機(jī)的透明玻璃箱。實(shí)驗(yàn)水溫在23～25℃，水深在300 mm左右。實(shí)驗(yàn)第1天為適應(yīng)階段，將大鼠放入水中自由活動5 min，24 h后（第2天），用同樣的方法記錄自由活動5 min。每只大鼠游泳后都更換清水，游泳測試結(jié)束后將大鼠擦干，放回籠中。實(shí)驗(yàn)記錄分析大鼠的漂浮不動時(shí)間。

2.5 高爾基染色 大鼠稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，50 mg/kg）進(jìn)行深度麻醉，然后快速剝離出腦組織，并用三蒸水迅速沖洗腦組織表面的血液；再將腦組織切片，厚度不超過1 cm，放入浸漬液中浸泡（按照FD Rapid GolgiStain?Kit說明書進(jìn)行操作）。取出浸泡好的腦組織，慢慢放入含有干冰的異戊烷快速冷凍組織；將冷凍好的組織固定在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行切片，切片厚度為100 μm。切片置于室溫黑暗處自然風(fēng)干，然后進(jìn)行染色，三蒸水洗片2次，每次4 min，再用工作液（FD Rapid GolgiStain? Kit提供）染片10 min，三蒸水洗2次。在50%、75%和95%乙醇中進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)梯度4 min。之后再在無水乙醇中脫水4次。在二甲苯中進(jìn)行透明3次，之后用樹脂封片劑封片。在顯微鏡下拍照觀察。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，50 mg/kg）進(jìn)行麻醉，快速取出腦組織于冰上分離前額葉皮層和海馬組織，速凍并轉(zhuǎn)移至-80℃保存。提取蛋白質(zhì)，BCA法測蛋白濃度。配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，I抗（抗PSD-95抗體，1∶1 000；Abcam）4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入II抗（anti-mouse IgG，HRP-linked antibody，1∶2 000；Cell Signaling Technology）室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL進(jìn)行曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥前，與Wistar大鼠相比，WKY大鼠糖水偏好程度明顯降低（P＜0.05），表明WKY大鼠表現(xiàn)出快感缺失的抑郁樣行為；經(jīng)過21 d藥物干預(yù)后，WKY+JYW組和WKY+CPM組大鼠比給藥前的WKY大鼠糖水偏好程度明顯提高（P＜0.05），說明解郁丸使WKY大鼠的抑郁樣行為有所減少；藥物組之間無明顯差異，見圖1A。

2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與Wistar大鼠相比，WKY抑郁大鼠給藥前在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時(shí)間明顯增加（P＜0.05），即WKY大鼠表現(xiàn)出明顯的絕望抑郁樣行為；但給予藥物治療21 d后的WKY大鼠此情況明顯好轉(zhuǎn)，即WKY+JYW組和WKY+CPM組不動時(shí)間較給藥前的WKY大鼠顯著減少（P＜0.05），藥物組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1B。

3 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠給藥前的總運(yùn)動距離（P＜0.01）和在中心區(qū)的停留時(shí)間（P＜0.05）明顯降低，即WKY大鼠表現(xiàn)出對陌生空間的探索活動減少；但給予藥物治療21 d后的WKY大鼠此情況得到逆轉(zhuǎn)，即WKY+JYW組和WKY+CPM組總運(yùn)動距離（P＜0.01）和中心探索時(shí)間（P＜0.05）顯著增加，藥物組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1C、D。

4 前額葉皮層與海馬組織高爾基染色結(jié)果

Golgi染色觀察顯示，與正常對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠前額葉皮層與海馬組織中的樹突棘明顯減少（P＜0.01），但在給藥治療后前額葉皮層和海馬組織中樹突棘密度顯著增多（P＜0.01），且藥物組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的表達(dá)水平

與對照組Wistar大鼠相比，WKY大鼠的前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），經(jīng)過21 d的藥物治療后，前額葉皮層與海馬中的PSD-95的表達(dá)水平增加（P＜0.01），而藥物組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

討 論

在研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制以及尋找新藥的作用靶點(diǎn)過程中，雖然以人類為研究對象更為直接，但是倫理的局限性讓我們不能更為深入地探討，因此在抑郁癥動物模型上的研究可能會大大提高我們對抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及對新藥作用機(jī)制的理解。WKY大鼠是一種內(nèi)源性抑郁樣大鼠模型，是通過其同品系Wistar大鼠雜交篩選獲得的大鼠，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抑郁癥的研究[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)該模型動物在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的活動明顯減少，不動時(shí)間延長[9]。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)WKY大鼠對糖水的偏好程度下降，表現(xiàn)出抑郁癥中的快感缺失，同時(shí)強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間增加，展示出絕望的抑郁樣表現(xiàn)，并且曠場實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)WKY大鼠活動距離減少，在中心探索的時(shí)間也下降，顯示出探索能力下降的抑郁樣表現(xiàn)，這些行為學(xué)結(jié)果與抑郁癥患者表現(xiàn)一致，經(jīng)過中草藥解郁丸21 d的干預(yù)之后，發(fā)現(xiàn)WKY大鼠的上述抑郁樣行為有明顯逆轉(zhuǎn)，且與西酞普蘭組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示解郁丸對WKY抑郁模型大鼠長時(shí)間的治療可以同樣達(dá)到較好的效果。

Figure 1.The results of behavioral experiments.A：the results of sucrose preference test；B：immobility time in the forced swimming test；C：center time in the open-field test；D：total distance in the open-field test.Mean±SEM.n=15.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Wistar group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WKY group.圖1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樹突棘是興奮性突觸的主要突觸后結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它們通常接受來自軸突的興奮性輸入，構(gòu)成大部分興奮性突觸的突觸后膜。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大部分興奮性突觸位于樹突棘上，是神經(jīng)元連接、信息存儲和處理大腦回路的、重要高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，重度抑郁癥患者的前額葉皮層中突觸蛋白表達(dá)減少，突觸數(shù)目減少[13]，且海馬存在樹突棘萎縮，樹突棘密度減少的病理狀態(tài)[14]。在慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）大鼠模型上，發(fā)現(xiàn)海馬和內(nèi)側(cè)前額葉皮層的主要神經(jīng)元中樹突棘密度下降[15-16]。在本研究中，WKY大鼠模型中同樣發(fā)現(xiàn)海馬和前額葉皮層中樹突棘的密度降低，通過解郁丸或西酞普蘭治療后能夠提高WKY大鼠樹突棘密度值。因此，我們認(rèn)為樹突棘具有高度的敏感性，可能是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要結(jié)構(gòu)之一，有可能成為研制新型抗抑郁藥物的重要靶結(jié)構(gòu)。

PSD-95是突觸后致密區(qū)核心構(gòu)架蛋白之一，位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有軸-樹突棘突觸的突觸后膜上，參與神經(jīng)元生長、突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)等[17]，是突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究表明，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95蛋白表達(dá)是減少的[18]；王雪銀等[19]發(fā)現(xiàn)，PSD-95表達(dá)的增加可以增強(qiáng)阿爾茲海默病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。同樣在本研究中發(fā)現(xiàn)WKY抑郁大鼠的前額葉皮層與海馬組織中PSD-95的表達(dá)是降低的，經(jīng)過藥物治療后明顯提高了PSD-95的表達(dá)水平，提示抑郁癥的發(fā)生以及抗抑郁藥物的作用機(jī)制與突觸可塑性均存在著聯(lián)系，可以應(yīng)用PSD-95作為治療抑郁癥的觀察指標(biāo)之一。

綜上所述，我們觀察到WKY抑郁樣模型大鼠具有快感缺失、絕望、認(rèn)知下降等抑郁樣行為表現(xiàn)，并且海馬與前額葉皮層中樹突棘密度明顯下降，PSD-95蛋白的表達(dá)水平也降低，說明樹突棘的變化是抑郁癥導(dǎo)致的分子結(jié)構(gòu)改變之一，抑郁癥的發(fā)生與突觸可塑性存在著聯(lián)系。以西藥西酞普蘭為陽性對照藥物，解郁丸可以減少WKY大鼠的抑郁樣行為，并提高海馬與前額葉皮層中的樹突棘密度及PSD-95蛋白的表達(dá)量，提示中藥解郁丸長時(shí)間應(yīng)用效果與西藥的藥效相當(dāng)，而且副作用少。本研究為解郁丸在臨床上的應(yīng)用提供了更多的支持依據(jù)。

Figure 2.The results of Golgi staining.Dendritic spines in the prefrontal cortex（A）and hippocampus（B）were visualized by Golgi staining.The scale bar=10 μm.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs Wistar group；##P＜0.01 vs WKY group.圖2 高爾基染色結(jié)果

Figure 3.The protein expression of PSD-95 in prefrontal cortex（A）and hippocampus（B）of rats was detected by Western blot.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs Wistar group；##P＜0.01 vs WKY group.圖3 Western blot檢測PSD-95蛋白的表達(dá)水平