基于高遷移率族蛋白B1信號(hào)通路分析烏司他丁對(duì)早期放射性肺損傷的保護(hù)機(jī)制Δ

楊 俊，胡 克，杜春玲，盧進(jìn)昌，周 磊，湯繼英

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430060； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸內(nèi)科，上海 201700； 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000)

放射性肺損傷為胸部惡性腫瘤放射治療常見并發(fā)癥之一，早期可致肺部充血、肺泡纖維蛋白滲出增多[1]。隨著放射劑量及放療時(shí)間的增加，最終可形成肺間質(zhì)纖維化[2]。研究結(jié)果顯示，接受放療的非小細(xì)胞肺癌患者放射性肺損傷發(fā)生率約為20%，并隨放療劑量增加而明顯升高[3]。放射性肺損傷是影響胸部惡性腫瘤患者放療效果的重要因素之一[4]。因此，積極防治放射性肺損傷對(duì)惡性腫瘤患者治療的有效性具有重要意義。目前，放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制尚未明確，大多認(rèn)為與肺組織受照射后腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)參與趨化炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺組織異常損傷及修復(fù)有關(guān)[5]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)為重要炎癥介質(zhì)，既可由活化后巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞主動(dòng)分泌，又可由損傷壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放[6]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1可參與放射性肺損傷過程，與肺纖維化改變有關(guān)[7]。烏司他丁是一種具有抑制多種蛋白水解酶活力作用的糖蛋白，常用于治療胰腺炎[8]。烏司他丁可通過抑制HMGB1蛋白表達(dá)減輕急性肺損傷程度[9]。因此，本研究基于HMGB1信號(hào)通路，探討烏司他丁對(duì)早期放射性肺損傷的保護(hù)機(jī)制，希望為臨床防治放射性肺損傷提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠36只，雌性，SPF級(jí)，周齡為10周，體質(zhì)量180～270 g，平均體質(zhì)量(241.36±5.42) g，購置于南京君科生物工程有限公司，貨號(hào)J001。置于光暗周期12 h，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分籠喂養(yǎng)，自由飲食及飲水。本研究符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。根據(jù)干預(yù)方式的不同將大鼠分為正常對(duì)照組、放射性肺損傷組及烏司他丁組，每組12只。

1.2 主要試藥與儀器

10%水合氯醛溶液(上海信帆生物科技有限公司，貨號(hào)XFA1600)；注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H19990134，規(guī)格為10萬IU/瓶)；烏拉坦(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)U2500)；PBS溶液、中性甲醛固定液、蘇木素染色液、伊紅染色液、酸性乙醇分化液(0.5%)、氨水溶液(0.5%)、中性樹膠、全蛋白提取試劑盒、硝酸纖維素膜(0.45 μm)、5%BSA封閉液、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒(小鼠IgG)、麗春紅染色液(1×)、總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；快速瑞式-姬姆薩復(fù)合染液(上海鈺博生物科技有限公司)；HMGB1、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、TNF-α、IL-6、IL-1β及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均購自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自美國(guó)Abcam公司；氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H51021157，規(guī)格為250 ml∶2.25 g)；腫瘤放療模擬定位機(jī)(德國(guó)西門子公司)；60Co-γ射線放射治療機(jī)(醫(yī)院放療科)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)；紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司，型號(hào)GENESYS 180)。

1.3 放射性肺損傷大鼠模型構(gòu)建與干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周后，以10%水合氯醛溶液腹腔注射，400 mg/kg，仰臥于處置板上充分暴露胸部，模擬機(jī)下定位；鉛塊遮擋左肺以及縱膈，正常對(duì)照組大鼠不進(jìn)行照射，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠以60Co-γ射線照射右肺，源皮距100 cm，照射視野2 cm×3 cm，照射總量30 Gy；照射完畢后，三組大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲食及飲水；照射后48 h，烏司他丁組大鼠給予注射用烏司他丁10 萬IU/kg，尾靜脈注射，給予正常對(duì)照組和放射性肺損傷組大鼠相同體積的氯化鈉注射液，尾靜脈注射；注射完畢后4 h，麻醉處死大鼠。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材

(1)肺支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞涂片：腹腔注射烏拉坦1 g/kg；頸部正中切口分離氣管，環(huán)狀軟骨處作小切口，結(jié)扎左主支氣管，以氯化鈉注射液5 ml灌洗右肺，重復(fù)3次；離心處理?xiàng)壣锨逡?，加入PBS溶液重懸細(xì)胞制作細(xì)胞涂片。(2)肺組織：收集BALF后行開胸手術(shù)取右肺中葉組織，PBS溶液沖洗3次，裁剪為0.5 cm×2 mm組織塊，置于中性甲醛固定液中固定24 h，取出依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋處理，將蠟塊置于切片機(jī)上，制成厚度為4 μm的連續(xù)切片。

1.5 肺組織形態(tài)學(xué)

采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法。取大鼠肺組織切片，依次進(jìn)行脫蠟、脫水處理后滴加蘇木素染色液染色5 min，PBS溶液沖洗；滴加酸性乙醇分化液分化，PBS溶液沖洗5 min；滴加氨水溶液反應(yīng)30 s，PBS溶液沖洗2 min；滴加伊紅染色液染色2 min，依次進(jìn)行脫水和透明處理，利用中性樹膠封片，顯微鏡(400×)下觀察染色結(jié)果。

1.6 BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用瑞式-姬姆薩染色法。取大鼠BALF細(xì)胞涂片以快速瑞式-姬姆薩復(fù)合染液染色2 min，顯微鏡下觀察涂片體、尾交界處染色情況，隨機(jī)選取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分類，中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)為粉紅色含紫紅色顆粒，嗜酸粒細(xì)胞含大量橘黃色顆粒，單核細(xì)胞質(zhì)為灰藍(lán)色，淋巴細(xì)胞為淡藍(lán)色。

1.7 肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法。按照全蛋白提取試劑盒說明書操作，提取大鼠肺組織中總蛋白，并進(jìn)行定性和定量分析；吸取40 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳至溴酚藍(lán)跑出，終止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；硝酸纖維素膜置于水上預(yù)處理2 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，置于脫色搖床以麗春紅染色液染色5 min，自來水沖洗后將膜晾干；PBS溶液從下往上將膜浸濕后，移至含5%BSA封閉液的平皿中，室溫下置于脫色搖床封閉1 h；分別滴加一抗后，4 ℃過夜；滴加二抗，室溫孵育2 h；按照ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒說明書操作，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析條帶并計(jì)算各蛋白表達(dá)量。

1.8 肺組織中HMGB1蛋白及下游基因mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。按照總RNA提取試劑盒說明書操作，提取大鼠肺組織中RNA，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)處吸光度，以A260/A280比值判定RNA純度，A260/A280比值介于1.8～2.0，提示樣品中RNA純度佳可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以GAPDH為內(nèi)參基因，GAPDH上游引物為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，下游引物為5′-GGGGT CGTTGATGGCAACA-3′，HMGB1上游引物5′-GCTGACAAGGC TGCTTATG-3′，下游引物為5′-CCTTTGATTCGGGCCCTATC-3′，RAGE上游引物為5′-CTTG CTCTATGGGCAGCTAC-3′，下游引物為5′-ATTGCCTCGCACCGGAATTC-3′，NF-κB上游引物為5′-ATGGCAGAGGATCAGTCCTA-3′，下游引物為5′-CGGAATCGAA TAAGGCCCTT-3′，TNF-α上游引物為5′-CAGGCGGTGCC TATGTCGTC-3′，下游引物為5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTCG-3′，IL-6上游引物為5′-CTGCAAGCAGACTTCCATCC-3′，下游引物為5′-AGTAGTATAGACAGGTCTGT-3′，IL-1β上游引物為5′-GCACGACTTGCTACGTTCAT-3′，下游引物為5′-CATGATCTT GGGGCTACTAT-3′；反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物 0.4 μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl、cDNA 2 μl、ddH2O 6.8 μl，總體積20 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，利用Image J軟件測(cè)定灰度值，以2-ΔΔCt表示各蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)

經(jīng)射線照射處理2周后，正常對(duì)照組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；放射性肺損傷組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)增厚；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中炎癥細(xì)胞明顯減少，肺間質(zhì)水腫明顯緩解，見圖1。

A.正常對(duì)照組；b.放射性肺損傷組；c.烏司他汀組A.normal control group; B.radiation-induced pulmonary injury group; C. ulinastatin group

2.2 各組大鼠BALF中白細(xì)胞種類計(jì)數(shù)比較

與正常對(duì)照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表1 三組大鼠BALF中白細(xì)胞種類所占比例比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與放射性肺損傷組比較，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

2.4 各組大鼠肺組織中HMGB1及下游基因mRNA表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠肺組織中HMGB1及下游基因mRNA表達(dá)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與放射性肺損傷組比較，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

3 討論

放療為胸部惡性腫瘤重要治療手段之一，主要通過α、β、γ射線以及各類X射線殺死處于分裂周期的惡性腫瘤細(xì)胞[10]。放射線在殺死惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也不可避免地對(duì)靶器官或組織造成不同程度的直接或間接損傷。放射性肺損傷為胸部惡性腫瘤患者放療常見并發(fā)癥，肺部組織纖維化的改變不僅可限制放療劑量，還可對(duì)患者治療效果產(chǎn)生影響[11]。放射性肺損傷根據(jù)發(fā)生時(shí)間不同可分為早期和晚期。目前，早期放射性肺損傷患者多可通過對(duì)癥處理得到緩解，而晚期患者肺損傷多不可逆，預(yù)后較差。因此，早期放射性肺損傷的防治成為目前臨床研究熱點(diǎn)。HMGB1是一種高度保守的炎癥介質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。HMGB1可通過參與腫瘤細(xì)胞自噬、凋亡、增殖過程及促進(jìn)炎癥反應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療等治療產(chǎn)生抵抗[12]。徐僑翌等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞異常增殖小鼠肺成纖維細(xì)胞核內(nèi)存在HMGB1的主動(dòng)分泌。烏司他丁為一種蛋白水解酶抑制劑，其可通過清除機(jī)體內(nèi)氧自由基和抑制炎癥因子釋放，減少細(xì)胞或組織損傷[14]。烏司他丁是否對(duì)放射性肺損傷具有保護(hù)作用，本研究基于HMGB1信號(hào)通路進(jìn)行了分析。

本研究中HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，放射性肺損傷組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)增厚；烏司他丁組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)中炎癥細(xì)胞較放射性肺損傷組明顯減少，肺間質(zhì)水腫明顯緩解。同時(shí)對(duì)大鼠BALF中白細(xì)胞種類進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例升高，與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例降低。以上結(jié)果提示，早期放射性肺損傷主要表現(xiàn)為肺組織支氣管、黏膜下及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)水腫，烏司他丁對(duì)減輕肺部損傷具有一定作用。NF-κB是一類關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于幾乎所有類型細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。研究結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6及IL-1β等參與炎癥反應(yīng)各階段的炎癥因子均可受NF-κB調(diào)控[15]。時(shí)磊等[16]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活化與放射性肺損傷肺部炎癥反應(yīng)和纖維化有關(guān)。RAGE基因是體內(nèi)過量的糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物，可與人體內(nèi)各種組織細(xì)胞結(jié)合參與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性退化性疾病[17]。研究結(jié)果顯示，HMGB1主要通過與RAGE結(jié)合參與炎癥反應(yīng)等病理過程[18]。TNF-α、IL-6及IL-1β為常見促炎因子，與放療所致肺損傷密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高，而烏司他丁組大鼠肺組織HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)水平較放射性肺損傷組明顯降低。

綜上所述，烏司他丁可能通過降低HMGB1及其下游蛋白表達(dá)，中斷HMGB1信號(hào)通路，減輕早期放射性肺損傷大鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有可能成為預(yù)防和治療早期放射性肺損傷的藥物。