基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的潛降湯治療高血壓作用機制研究Δ

白雅瀅，劉殊羽，倪夢蔚，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

高血壓是心血管疾病最重要的危險因素，也是常見的慢性非傳染性疾病，我國居民的死亡原因中，高血壓所占比重很大[1]。目前，高血壓的治療方法普遍為藥物治療，但西藥治療多為單一用藥，存在一定的局限性，在長期治療中可能產(chǎn)生耐藥性從而影響療效[2]。潛降湯是國醫(yī)大師顏正華先生治療肝陰不足、肝陽上亢證的自擬方，在治療高血壓、眩暈等疾病上獨有建樹，其組方為：熟地黃、白芍合為君藥，石決明、牡蠣共為臣藥，茯苓、丹參、懷牛膝和益母草4味藥為佐藥，夜交藤、白菊花作為使藥；諸藥合用，達到滋陰平肝、潛陽安神的功效[3]。中醫(yī)藥治療高血壓肝陽上亢證，基于辨證施治的原則，從陰虛陽亢的基本病機出發(fā)，多使用平肝潛陽藥(菊花、牡蠣)、滋陰藥(白芍)、清熱藥(牡丹皮)和健脾藥(茯苓)等，在潛陽、滋陰的基礎(chǔ)上清熱、健脾氣，從而起到治療效果[4]。中藥方劑治療是中醫(yī)臨床治療的主要形式，具有“多組分、多靶點”的作用特點，講求各單味中藥在配伍下的共同作用[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究和預(yù)測潛降湯治療高血壓的作用機制，以期為中藥方劑用于高血壓的治療提供思路和參考。

1 資料與方法

1.1 潛降湯藥物化合物的檢索

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，收集潛降湯方中熟地黃、白芍、茯苓、益母草、懷牛膝、丹參和白菊花(菊花)7味藥物的活性化合物；補充查閱相關(guān)文獻，尋找石決明、牡蠣和夜交藤的活性化合物。

1.2 對檢索化合物的篩選

藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是衡量藥物體內(nèi)藥動學(xué)過程以及成藥性的重要參數(shù)，表示藥物的有效成分或活性被吸收進入血液循環(huán)，在活性位點起作用的速度和作用程度[6]。類藥性(drug-likeness，DL)是預(yù)測化合物是否具備成為藥物條件的指標[7]。本研究中，以O(shè)B≥35，DL≥0.18為閾值，篩選熟地黃、白芍、益母草、懷牛膝、茯苓和菊花的活性化合物；以O(shè)B≥50，DL≥0.18為閾值，篩選丹參活性化合物；同時，結(jié)合文獻檢索的石決明、牡蠣和夜交藤的活性化合物。

1.3 潛降湯“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

依托TCMSP、Supered數(shù)據(jù)庫(http：//prediction.charite.de/index.php?site=chemdoodle_search_target)和Stitch數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，預(yù)測化合物的作用靶點，利用Cytoscape軟件構(gòu)建潛降湯的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，探究潛降湯活性化合物和相關(guān)靶點的相互作用。

1.4 “潛降湯化合物-高血壓交集靶點”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

綜合利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，進行高血壓疾病靶點的預(yù)測；在全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫UniProt(https：//www.uniprot.org/)中進行基因名轉(zhuǎn)換，篩選出與化合物靶點相同的靶點；在String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/cgi/input.pl)中對疾病和化合物的共有靶點進行PPI分析，利用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

采用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)(https：//david.ncifcrf.gov/)平臺，對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以說明藥物靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

1.6 整體研究過程

整體研究過程見圖1。

圖1 整體研究過程

2 結(jié)果

2.1 潛降湯方中活性化合物的篩選

收集到潛降湯方中中藥活性化合物共887個，其中熟地黃76個，白芍85個，茯苓34個，丹參202個，益母草51個，懷牛膝76個，石決明和牡蠣共1個，夜交藤3個，白菊花(菊花)359個。根據(jù)篩選閾值和相關(guān)文獻(石決明[8]、牡蠣[9]和夜交藤[10-11])，最終統(tǒng)計得到69個符合篩選條件的化合物，見表1。

2.2 潛降湯的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)

潛降湯的69個活性化合物中，有48個化合物可得到預(yù)測靶點，合計580個。利用Cytoscape作圖軟件繪制潛降湯的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中，共包括628個節(jié)點(48個化合物節(jié)點，580個靶點節(jié)點)以及1 459條邊；其中，圓形節(jié)點代表藥物的活性化合物分子，菱形節(jié)點代表潛在靶點，每條邊代表化合物和靶點的作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)圖中，度值表示與節(jié)點相連的邊數(shù)，度值越大，與之相連接的化合物或靶點越多，越有可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點。以度值大小作為排列依據(jù)，將度值≥4的預(yù)測靶點置于化合物所圍成的圓圈中心，圓圈外的左側(cè)為度值在2～<4范圍內(nèi)的預(yù)測靶點，右側(cè)是度值為1的預(yù)測靶點。所得的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)中，活性化合物分子的平均度值為30.4，其中，化合物“epidanshenspiroketall-actone”(Com63)所對應(yīng)的潛在靶點數(shù)量最多，度值為122；其次為化合物“Przewaquinone B”(Com62)和化合物“Przewalskin B”(Com61)，度值均為100?；騎DP1的度值為25，是度值最高的潛在靶點；其次為基因AKR1B1，度值為18。

表1 潛降湯方中符合篩選條件的化合物

續(xù)表1

代碼化合物名稱OBDL來源Com59“2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde”[2-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-(3-羥丙基)-7-甲氧基-3-苯并呋喃甲醛]62.780.40丹參Com60“formyltanshinone”(甲?；⑼?73.440.42丹參Com61“przewalskin b”(紫丹參萜醚b)110.320.44丹參Com62“Przewaquinone B”(紫丹參乙素)62.240.41丹參Com63“epidanshenspiroketallactone”(表丹參螺旋縮酮內(nèi)脂)68.270.31丹參Com64“miltionone Ⅱ”(丹參醌新酮Ⅱ)71.030.44丹參Com65“prolithospermic acid”(原紫草酸)64.370.31丹參Com66“(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid”{(2R)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-[(Z)-3-(3,4-二羥基苯基)丙烯?；鵠氧基-丙酸}109.380.35丹參Com67“(Z)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl]-3,4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid”{(Z)-3- [2-[(E)-2-(3,4-二羥基苯基)乙烯基] -3,4-二羥基-苯基]丙烯酸}88.540.26丹參Com68“(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone”{(6S)-6-羥基-1-甲基-6-羥甲基-8,9-二氫-7H-萘[8,7-g]苯并呋喃-10,11-醌}75.390.46丹參Com69“(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione”{(6S)-6-(羥甲基)-1,6-二甲基-8,9-二氫-7H-萘[8,7-g]苯并呋喃-10,11-二酮}65.260.45丹參

注：“—”表示來自文獻，無篩選閾值

Note：“—” represents the compound came from literature, no screening threshold

圖2 潛降湯的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3 疾病靶標篩選及與化合物靶標的關(guān)聯(lián)

以“hypertension”(高血壓)為疾病名搜索TTD數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫，共得到相關(guān)靶點658個。對照由活性化合物所得的預(yù)測靶點，得到共有靶點60個。由于中藥的方藥治療機制是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并不僅是直接的作用通路，在信號通路和靶點之間可能還存在一定程度的信號轉(zhuǎn)換。于是，本研究利用String數(shù)據(jù)庫將共有靶點進行PPI分析，以探究靶點之間直接與間接調(diào)控的作用關(guān)系，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中，共包含90個潛降湯化合物與高血壓直接或間接的作用靶點，459條邊。度值≥20的節(jié)點包括STAT1、FYN、JAK2、CXCR4、AGT、STAT3、CXCL12、VEGFA、SRC和AKT1；AKT1的度值最高，為37；SRC的度值為30；CXCL12和VEGFA的度值均為27。

圖3 “潛降湯化合物-高血壓交集靶點”的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集與KEGG通路富集分析

在得到潛降湯化合物和高血壓交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，利用DAVID平臺，對得到的90個蛋白進行GO功能和KEGG通路富集分析。根據(jù)假定值(P)<0.01且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.01為標準，篩選出22個GO條目并作圖，見圖4。圖中，橫坐標為各條目名稱；柱狀圖對應(yīng)左列縱坐標，代表條目數(shù)目；折線圖對應(yīng)右列縱坐標，為P的負對數(shù)。22個GO條目中，4個條目與細胞組成有關(guān)；5個條目與酶功能相關(guān)；2個條目與基因表達調(diào)控相關(guān)；6個條目與生理功能相關(guān)，包括調(diào)節(jié)平滑肌和血管的收縮；5個條目與信號傳遞有關(guān)，如Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)級聯(lián)。KEGG通路富集分析中，經(jīng)過篩選后得到32條顯著富集的通路，見圖5。其中，富集基因數(shù)最多的通路為惡性腫瘤途徑，共28個基因；趨化因子信號通路和乙型肝炎通路上富集的基因數(shù)分別為22和18個；富集程度最高的通路為腎細胞癌通路，其次為急性髓系白細胞通路，另外，催乳信號途徑和慢性粒細胞白血病通路的富集程度也較高。

圖4 GO條目分析

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近20年來，我國人群高血壓患病率逐年升高，高血壓與心血管疾病的發(fā)生呈獨立、連續(xù)和直接的正相關(guān)關(guān)系，因此，如何有效治療高血壓仍是學(xué)者們不懈攻克的難題[12]。在高血壓的治療中，使用頻率較高的抗高血壓藥包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑、鈣通道阻滯劑、利尿劑和β受體阻斷劑[13]。目前，許多臨床研究多使用單一藥物治療高血壓；同時，大多數(shù)案例中對藥物作用靶點尚不清楚，缺少聯(lián)合用藥的藥動學(xué)及量效關(guān)系探究，患者在脫離抗高血壓藥的治療后容易反復(fù)發(fā)作，臨床治療效果不理想[14]。中醫(yī)藥對高血壓的認識有著獨特的理論體系支撐，平肝潛陽法是臨床治療高血壓肝陽上亢證的有效方法，可以顯著降低患者的血壓水平，并且可減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量。本研究所探究的方劑潛降湯在臨床上治療高血壓肝陽上亢證，對患者的各項癥狀以及并發(fā)癥均有很好的緩解效果。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究潛降湯治療高血壓的作用機制，與中藥方劑多組分、多靶點的特點相吻合的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重從整體、系統(tǒng)和藥物間相互作用的角度對藥物進行剖析，是研究中藥配伍及作用機制的新熱點[15]。

本研究在收集潛降湯和高血壓相關(guān)靶點的基礎(chǔ)上，對潛降湯和高血壓的交集靶點進行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對所得網(wǎng)絡(luò)進行分析，得到度值排序居前5位的關(guān)鍵靶點為AKT1、SRC、CXCL12、VEGFA和STAT3。研究結(jié)果顯示，在特發(fā)性肺動脈高壓中，AKT1信號聯(lián)級參與遠端肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移增強，具有無效AKT1編碼基因的小鼠患有肺動脈高壓的概率很低，因此，認為AKT1活性降低在特發(fā)性肺動脈高壓的治療方面有著重要意義[16]。有學(xué)者指出，SRC激酶對原發(fā)性高血壓大鼠模型中延髓頭端腹外側(cè)區(qū)投射的下丘腦室旁核神經(jīng)元突觸前和突觸后部位上N-甲基-D-天冬氨酸受體活性的增強起到關(guān)鍵作用，認為SRC激酶是治療神經(jīng)源性高血壓的潛在靶點[17]。度值排序居第3位的關(guān)鍵靶點CXCL12基因是影響冠心病的因素，研究結(jié)果表明，CXCL12基因會提高中國漢族人群的高血壓患病風(fēng)險，但其作用機制目前尚不明確[18]。VEGFA為血管內(nèi)皮生長因子A，其在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用。腎小管上皮細胞中表達的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以刺激NO生成，靶向VEGF的藥物與高血壓的快速發(fā)展相關(guān)，其作用機制與NO的代謝有關(guān)[19]。STAT3基因與JAK2-STAT3通路有關(guān)，孟憲卿等[20]研究了刺蒺藜治療肥胖型高血壓的機制，發(fā)現(xiàn)刺蒺藜可以通過調(diào)控瘦素介導(dǎo)的JAK2-STAT3通路，改善瘦素抵抗，治療肥胖型高血壓；由此推測，STAT3在肥胖型高血壓的治療中起到重要作用。

對PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，GO條目中，潛降湯治療高血壓的基因功能主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)等大分子相互作用、細胞質(zhì)膜構(gòu)成和系統(tǒng)過程的信號調(diào)控等方面，包括質(zhì)膜和質(zhì)膜組成、JAK-STAT級聯(lián)等。由于人體在高血壓狀態(tài)下細胞質(zhì)膜鈣泵功能低下，在基因表達水平下降以及高血壓狀態(tài)下，質(zhì)膜可能發(fā)生一定的理化狀態(tài)和性質(zhì)變化，這可能與細胞質(zhì)膜相關(guān)基因功能有關(guān)[21]。王俊巖等[22]在滋陰息風(fēng)方對自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，其可改善高血壓腎臟功能損傷，具體機制可能是通過抑制JAK-STAT信號通路的激活實現(xiàn)。KEGG通路涉及到的32個通路中包括趨化因子信號通路、惡性腫瘤信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路和催乳素信號通路等。趨化因子具有誘導(dǎo)白細胞聚集、黏附及游走的功能，與血管壁的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可見趨化因子與其相應(yīng)受體與高血壓發(fā)病機制有關(guān)；作用于趨化因子的相關(guān)藥物，能夠抑制血管壁的炎癥反應(yīng)過程，可能成為臨床上藥物治療高血壓的新靶點[23]。催乳素裂解會產(chǎn)生催乳素片段(16 kD PRL)，可抑制心臟血管的功能，促進血管收縮，使炎癥細胞黏附到內(nèi)皮細胞，并促進心室腔擴大，導(dǎo)致高血壓以及心功能不全的發(fā)生[24]。

綜上所述，本研究認為潛降湯在高血壓的治療中起到關(guān)鍵作用的靶點有AKT1、SRC、CXCL12、VEGFA和STAT3等，與質(zhì)膜組成、JAK-STAT級聯(lián)、趨化因子信號通路和催乳素信號通路等有關(guān)，但其具體的作用機制尚待實驗驗證。本研究的結(jié)果初步驗證了潛降湯對高血壓的治療作用和相關(guān)藥理學(xué)機制，為進一步深入研究潛降湯的應(yīng)用和治療高血壓的方法開闊了思路。