張銀冰
摘 ?要:電致化學發(fā)光分析法兼有電化學和化學發(fā)光分析法的雙重優(yōu)勢,具有靈敏度高、線性范圍寬、反應可控性強、背景干擾小、選擇性好和儀器簡單等優(yōu)點,己經(jīng)被廣泛應用于生物分子的檢測以及疾病的診斷等方面。生物傳感器是由生物識別元件和物理化學信號傳感系統(tǒng)組成的分析設備,可方便地進行生物分析檢測。本論文對基因組DNA羥甲基電致化學發(fā)光生物傳感研究進展現(xiàn)狀,進行了綜述。
關鍵詞:基因組;DNA羥甲基化;電化學發(fā)光;生物傳感器
電化學發(fā)光(Electrochemiluminescence),它不但有著英文縮寫名稱,還有另外一個名為電致化學發(fā)光(Electrogeneratedchemiluminescence)名稱。ECL是將電壓以及電流經(jīng)過電極施加到化學發(fā)光物質(zhì)上促進某種新物質(zhì)的衍生,該物質(zhì)和發(fā)光物質(zhì)會產(chǎn)生反應,供應充足的能量來改變發(fā)光物質(zhì)的狀態(tài),讓其從原本的基態(tài)變成了后來的激發(fā)態(tài),在重新回到基態(tài),經(jīng)過這樣的改變,給發(fā)光供應足夠的能量;亦或是將電壓以及電流經(jīng)過電極的方式供應能量,讓發(fā)光物質(zhì)可以產(chǎn)生氧化還原反應,讓中間態(tài)物質(zhì)在不穩(wěn)定的狀態(tài)下出現(xiàn)分解,供應能量促使發(fā)光。[1]所以,利用酶切來刪掉甲基基團,這是不可缺少的。這一點也是生物學家最關注的問題。人體內(nèi)的細胞有時為了再次分化,或許會對已經(jīng)分化后的細胞再一次進行分化,一直分化到最低的狀態(tài)為止,這個過程就是刪除甲基化的環(huán)節(jié),分析這個過程,對于醫(yī)療運用來說有著難以言喻的價值。
1DNA羥甲基化
1948年人們第一次從人類DNA中識別出了被稱為DNA“第五個堿基”的5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在真核生物中,DNA甲基化是在C-5位的胞嘧啶環(huán)上添加一個甲基后形成的。這個過程是在被稱為“CpG島”的y-CG-3^?列中經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化后發(fā)生的。5-mC是最常見的真核生物DNA修飾,也是許多表觀遺傳(只改變基因表達,而不改變核苷酸序列)現(xiàn)象的一種。[2]雖然甲基化DNA在植物和哺乳動物中分布廣泛,但在一些真核生物,比如果蠅和釀酒酵母中并未檢測到甲基化DNA^-84〗。于是,人們開始懷疑其在正常發(fā)育和特異性基因表達中的重要性。然而,最近的研宂表明,在敲除轉(zhuǎn)基因小鼠中對DNA甲基化起重要作用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因后,小鼠發(fā)育異常和胚胎致死的表達水平仍然下降,這就消除了人們之前的懷疑。[3]
DNA甲基化整體調(diào)控中的一個關鍵步驟是DNA去甲基化。用甲基敏感性內(nèi)切酶監(jiān)測DNA甲基化水平后發(fā)現(xiàn),在胚胎發(fā)育過程中,移植前的胚胎甲基化水平很低之后許多CPG島殘基發(fā)生再甲基化,但在移植時,剩余的CpG島并未發(fā)生甲基化。胚胎植入后,許多DNA被甲基化,而組織特異性(Tissue-specific)基因在其相應的表達組織中卻發(fā)生去甲基化。因此,對于生物的整個基因組DNA來甲基化模式是表觀遺傳信息的重要組成部分,是區(qū)分細胞的重要標記物。5-甲基胞嘧啶(5-mC)通常被認為是DNA的“第五個堿基”。在受精和胚胎發(fā)育后,大量輸甲基化標記物被刪除這使得胚胎干細胞能分化成任何可能的專職細胞。在某些情況下,DNA的去甲基化發(fā)生時沒有細胞分裂,也就沒有合成新的DNA。因此,甲基基團必須通過酶切主動地去除。主動去甲基化機制是人們最感興趣的,因為一些細胞為了重新分化,有可能主動進行DNA去甲基化換句話說,將己經(jīng)分化的細胞進行再分化,轉(zhuǎn)變?yōu)楦头只癄顟B(tài)的過程,就是主動去甲基化,這在醫(yī)療應用方面由很大的研究價值。說,肯定存在一種去除DNA中甲基胞嘧啶的方式。
2電致化學發(fā)光
最近幾年,由于電化學發(fā)光檢測技術的優(yōu)勢不斷的顯露,人們開始重視電化學發(fā)光檢測方式的運用,比如,其有著較高的靈敏性,操作流程簡單、反應迅速、節(jié)省試劑等。這些都是電化學發(fā)光檢測技術最顯著的優(yōu)點,它的出現(xiàn)促進了生物分析的發(fā)展,大大的提升了檢測生物分子的效率和質(zhì)量,并且日漸普遍。一直以來,生物學家都在尋找研究DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶活性的問題,也有不少的生物學家來不斷的檢測羥甲基化DNA,自從電化學發(fā)光檢測技術衍生后,生物學家找到來一個合適的分析和檢測平臺。
電致化學發(fā)光(ECL)分析法無論是從電化學的角度來說亦或是從化學發(fā)光分析法的角度來說,都是有著顯著的優(yōu)勢的,它有著較高的靈敏性,反應快,范圍廣,干擾性低,好選擇以及操作便利等等,這些都對研究有著很大的幫助。如今,電致化學發(fā)光(ECL)分析法在醫(yī)療領域開始普遍使用,其中運用最多的就是檢測生物分子,診斷患者的病情等等,可是學者對ECL分析法分析的成果不多,特別是檢測5-hmC更是少之又少。
3電化學發(fā)光DNA生物傳感器
生物傳感中的傳感系統(tǒng)涉及各種檢測器,如壓電,光學,電化學,電化學發(fā)光等。生物傳感方法近幾十年來蓬勃發(fā)展,為臨床早期診斷帶來了重大突破。商業(yè)化和臨床應用的生物傳感器應該具有穩(wěn)定、快速、高靈敏和廉價的特點。在對生物傳感有貢獻的技術中,電化學發(fā)光由于具有電勢可控和靈敏度高的雙重優(yōu)勢,引起了人們的廣泛關注。電化學發(fā)光生物傳感是將特異性識別物質(zhì)如抗體、酶、DNA等固定在電極上而組成的分析元件,通過目標分析物結(jié)合前后電化學發(fā)光強度的變化來進行定量檢測,廣泛應用于生物分析,免疫分析,食品安全和環(huán)境監(jiān)測等。其中,DNA是生物體遺傳信息的主要載體,引導生物發(fā)育與生命機能運作,電化學發(fā)光DNA生物傳感器結(jié)合了生物識別的特異性及ECL的高靈敏性,為DNA分析提供了一種很有前景的方法,越來越多的研究者致力于電化學發(fā)光DNA生物傳感的研究。
許多DNA檢測體系基于目標DNA與其互補探針的雜交,Li等報道了一種電化學發(fā)光生物傳感方法檢測DNA甲基化,該方法結(jié)合酶聯(lián)反應實現(xiàn)了對DNA甲基化水平的高靈敏檢測。[5]然而,該方法需要對目標分析物進行標記,使得分析過程比較復雜。Zhang等使用發(fā)夾DNA作為識別元件,以釕復合物作為信號物質(zhì),構(gòu)建了一種用于檢測靶單鏈DNA(ss-DNA)的高選擇性ECL生物傳感器。該ECL方法具有較高的靈敏度和很好的選擇性,并且不需要對目標分析物進行記。[6]
結(jié)束語
電化學發(fā)光分析法結(jié)合了發(fā)光分析高靈敏度和電化學電位可控等優(yōu)點,引起了諸多分析化學工作者的關注。電化學發(fā)光生物傳感器是將特異性分子識別物質(zhì)如酶、抗體或DNA等生物分子作為分子識別物質(zhì)固定在換能器上,以電化學發(fā)光信號為檢測信號的分析器件,其具有靈敏度髙、線性范圍寬、反應可控性強、成本低廉、分析速度快、操作簡單和易于微型化與集成化等優(yōu)點,己經(jīng)被用于一些疾病相關的生物標志物檢測。但是目前一些低水平的生物標志物檢測仍然是電化學發(fā)光生物傳感器面臨的一大挑戰(zhàn)。近年來,具有優(yōu)異性質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)、組成和形貌的納米材料的引入促進了電化學發(fā)光生物傳感器的發(fā)展,大大提髙了其檢測的靈敏度和選擇性。
參考文獻
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[4] ?DNA:FromCarrierofGeneticInformationtoPolymericMaterials[J].JiaojiaoZhang,F(xiàn)engLi,DayongYang.TransactionsofTianjinUniversity.2019(04)
[5] ?超聲波細胞粉碎機在高通量測序片段化DNA中的應用[J].李根亮,盧舒雨,許苡僥,黃捷,黃曉敏,肖娟,農(nóng)嵩.右江民族醫(yī)學院學報.2016(05)
[6] ?DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)探尋路上競爭中的合作[J].張翮.自然辯證法通訊.2017(03)
基金項目:國家自然科學基金項目(No.21575109)