淺析CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)展及其原理

李奕陽

摘 要：CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種對生物物基因組定點編輯技術(shù)。因為它操作簡單、成本低、耗時短等優(yōu)點，從而逐漸取代鋅指核酸酶（ZFNs）TALE核酸酶 （TALENs），成為對目標基因進行高效、定點編輯的技術(shù)，引起生物科學界的巨大變革。本文介紹了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理和優(yōu)勢，指出尚未解決的問題，結(jié)合其在各個國家的研究現(xiàn)狀，展望CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用前景。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9;基因編輯;基因治療

0 引言

原核生物基因內(nèi)的一段重復序列稱為CRISPR，是其在長期而復雜的進化過程中獲得的對抗病毒侵入的免疫工具。概括地說，病毒通過對自身的基因整合進入細菌體內(nèi)完成侵入，并利用細菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行復制繁殖，而細菌演化出CRISPR-Cas9系統(tǒng)，抵抗這種侵入。通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)，細菌可以將自身基因內(nèi)病毒侵入的片段進行切除，從而實現(xiàn)免疫防御。

細菌擁有多種手段切除病毒的遺傳信息，通過合成一種特殊的復合物進行切除的方法最為常見，該復合物可以定向地尋找特定的基因序列，之后進行定點切除。該復合物在細菌體內(nèi)較為復雜，有Cas9蛋白參與基因組的定點編輯，這種技術(shù)被命名為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在當下?lián)碛蟹浅V闊的科研前景，并且逐漸開發(fā)完善。此系統(tǒng)具有低成本、易操作、精準度高、周期短等優(yōu)點[1]。

1 CRISPR系統(tǒng)簡介

CRISPR技術(shù)具有改變生物科技領(lǐng)域基本規(guī)則的能力，這種系統(tǒng)主要分為兩個部分，具有引導功能的sgRNA以及具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的科研前景非常廣闊，可以改變生物的遺傳物質(zhì)達到改變性狀的目的，通過對植物的基因組定點編輯加強該植株對某種特定病毒的抵抗能力;通過修復細胞DNA治療特定遺傳病等。

CRISPR是在微生物的免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，通過對Cas9酶的利用，能在DNA中插入作為引導序列的RNA，之后實現(xiàn)切除DNA片段等目的。有研究表明，sgRNA的加入，能更有效地讓基因組產(chǎn)生突變，效率比以往的傳統(tǒng)基因編輯手段要高。雖然具有高效性和廣泛的適應性，但是CRISPR-Cas9技術(shù)在目標細胞的編輯中依舊會產(chǎn)生“脫靶效應”，各科研機構(gòu)仍在尋找有效的改進方法。

從20世紀90年代初CRISPR技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，到七年后首次應用在生物工程領(lǐng)域，CRISPR技術(shù)迅速地發(fā)展成為各大領(lǐng)域主要的基因組定點編輯的新工具。2012年，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種強大的基因組編輯技術(shù)對生物DNA進行修飾，并命名為CRISPR。美國約翰·霍普金斯大學醫(yī)學院證明，這個技術(shù)可以應用于人體干細胞的編輯。這一發(fā)現(xiàn)有利于更簡捷地修飾誘導多功能干細胞的基因組，加速了該技術(shù)進行臨床實驗的進程，并被發(fā)表于《分子治療》上。2015年1月6日，為了研究人體內(nèi)其他細胞是否能進行這樣的操作，研究小組分別用CRISPR和TALEN在人體的IPSCs上進行試驗，方法是切下已知基因片段或切下后換上指定序列。將JAK2、SERPINA1和AAVS1基因設定為模型，通過JAK2基因的變異會引起骨髓紊亂，真性紅細胞增多癥;SERPINA1基因變異會導致alpha1-抗胰蛋白酶缺乏，這是一種遺傳性紊亂，會造成肺和肝臟疾病;而AAVS1最近發(fā)現(xiàn)是人類基因組中的“安全港”，可以插入外來基因[2]。

通過比較發(fā)現(xiàn)，在這三個基因系統(tǒng)中，如果只是簡單地切掉部分基因，CRISPR系統(tǒng)明顯比TALEN更有效，產(chǎn)生的剪切效率遠大于后者;在替換基因時，如替代JAK2和SERPINA1中的致病變異，CRISPR和TALEN的效率相差無幾。研究人員指出，與癌細胞研究不同的是，無論CRISPR還是TALEN，在人體中都有著指定的目標，即不會替換其他基因。還發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：CRISPR可以只瞄準變異的基因，而不傷害其他細胞中健康的等位基因。若該發(fā)現(xiàn)成功地與干細胞的研究相結(jié)合，就可以使CRISPR成為目前風險最小的人體IPSCs基因編輯手段。約翰·霍普金斯大學醫(yī)學院導師葉朝輝說：“干細胞技術(shù)正在迅速發(fā)展。我們認為，將iPSCs用于人類治療的日子已經(jīng)不遠”。他們的研究詳細說明了如何將CRISPR技術(shù)用于人類iPSCs，展現(xiàn)了該技術(shù)在這類細胞中的研究潛力。

中國科研團隊對CRISPR系統(tǒng)的研究和應用進行得如火如荼。2014年，南京大學的研究人員成功編輯猴的基因，這是歷史上首次成功編輯非人類靈長目動物的基因。2016年8月，四川大學華西醫(yī)院腫瘤學家盧鈾帶領(lǐng)團隊首次進行對人體使用CRISPR技術(shù)進行基因編輯和臨床應用。這些研究人員計劃招募一批保守治療已經(jīng)無望的非小細胞肺癌患者。從患者身體血液中提取免疫細胞，利用CRISPR定向清除腫瘤的新基因序列，然后再把這些細胞注入患者的血液，成為新的抗體，2018年7月，CRISPR基因編輯實驗在中國進行，并將嘗試使用CRISPR技術(shù)來破壞人類乳突瘤病毒（HPV）的基因，并有效地降解入侵病毒，據(jù)悉，人類乳突瘤病毒已被證實可促使宮頸癌腫瘤生長[3]。

1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與分類

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由tracrRNA序列區(qū)、cas基因序列區(qū)、crispr序列區(qū)三個功能部分組成。CRISPR系統(tǒng)主要分為三大類：Type I、Type II、Type III，而在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的Cas9基因?qū)儆赥ype II，根據(jù)系統(tǒng)中包含的Cas基因種類的不同，又將Type II再細分為三種亞型：Type IIA、Type IIB、Type IIC。通常Type II型系統(tǒng)通常包括Cas9、Cas1、Cas2基因和CRISPR序列。

1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)原理

CRISPR-Cas9免疫系統(tǒng)能夠有效保護細胞，當病毒二次侵入細胞時，整合了該病毒基因片段的crispr位點經(jīng)轉(zhuǎn)錄會形成crRNA（不成熟的crRNA），成熟的crRNA會與加工過的tracrRNA招募Cas蛋白形成二元復合體，完成之后，與病毒的DNA特異位點互補配對結(jié)合，Cas蛋白就會切割靶DNA造成DSB，從而實現(xiàn)Cas9核酸酶對結(jié)合位點進行切割。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在目標基因的特異位點引入雙鏈結(jié)構(gòu)切割后，細胞可以通過兩種主要的形式對該缺口進行修復。一種主要的修復機制是非同源染色體的末端連接，另一種方法是利用外源性修復模版作為參照，對同源DNA的修復則更加準確地進行，從而實現(xiàn)特定的基因片段插入或替換。更為重要的是，對比現(xiàn)有的基因編輯手段，CRISPR技術(shù)對基因的編輯是具有遺傳性的，通過改變親本的基因序列，經(jīng)過有性繁殖之后的子代也會擁有相同的基因序列，從而實現(xiàn)永久地消除基因缺陷，換言之就是永久地免疫該類病毒。近些年來，CRISPR的基因編輯已經(jīng)在動物身上試驗并取得巨大的成功，并且在人類遺傳疾病上得到了更加深入的嘗試。重點是，在病毒的基因序列被Cas蛋白整合進自身序列中的時候，需要靶序列后面跟隨PAM。在II型CRISPR系統(tǒng)中，NGG的三堿基序列通常構(gòu)成PAM，這是使用CRISPR技術(shù)的唯一限制條件，即細胞基因內(nèi)含有GG的堿基序列[4]。而在人體中，通過遺傳分析可知道，每8個堿基對就會出現(xiàn)一次GG堿基序列，所以可以認為在人體上使用CRISPR技術(shù)并不受任何原理上的限制。

外顯子測序和全部基因編碼的測序極大的促進了一些罕見遺傳病的研究進程和對單基因突變的篩查。據(jù)研究顯示，絕大多數(shù)遺傳病是由其致病基因特定外顯子的點突變造成的。在基因轉(zhuǎn)錄的過程中，點突變可以將生物信號進行剪切或者停止發(fā)出，從而阻礙對應的mRNA或者蛋白質(zhì)的合成或特定功能的喪失。因此，通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在特定點突變位置附近引入DNA雙鏈切口，并且通過后續(xù)的同源或非同源修復作用，從而實現(xiàn)對突變引起的家族遺傳病進行特定的修復。

1.3 CRISPR系統(tǒng)相關(guān)應用

2014年，Yin等人發(fā)表了利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導的HDR來修復Fah基因點突變治療遺傳性高酪氨酸血癥的研究。在該疾病的研究中，研究人員設計了多個靶向的Fah基因第8號外顯子的gRNA，其與Cas9基因序列共同構(gòu)建至質(zhì)粒，并成功表達。該治療策略取得了很大的成功。因此這個方案在類似的家族遺傳病的研究上也進行了嘗試。例如對新生小鼠注射cas9系統(tǒng)和DNA模板有關(guān)病毒，成功地修復了小鼠OTC基因第4號外顯子的G→A的點突變。在上述實驗中，通過cas9系統(tǒng)對目標點突變進行修復的效率并不相同[5]。一般認為，雖然基因序列的修復效率與HDR的效率成正比，但后者的發(fā)生概率要遠小于前者，因此設計合適的gRNA模版更為重要。

2 展望

CRISPR系統(tǒng)依靠sgRNA分子將目的基因?qū)蛱囟―NA位點，利用Cas9酶編輯DNA，以擾亂基因或插入目的基因。在實驗時，研究人員需要訂購的只是RNA片段，其他成分都是現(xiàn)成的。全部花費只有30美元，這是該技術(shù)走進更多實驗室的重要原因。CRISPR方法幾乎完勝鋅指核酸酶技術(shù)和其他編輯工具。對一些研究人員來說，這意味著要放棄數(shù)年來完善的技術(shù)。一些研究人員嚴重依賴諸如小鼠、果蠅等模式生物。CRISPR使在更多生物體中編輯基因成為可能。

CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)進行到現(xiàn)代生物學各項領(lǐng)域，但也存在一定局限性。在2015年3月，一個研究小組在《自然》雜志發(fā)表公開信，提出“嚴重擔憂”編輯人類基因“種系”產(chǎn)生的倫理道德和安全問題。研究人員對此方面仍有所顧慮，他們認為大量噬菌體侵入人體免疫系統(tǒng)會引發(fā)免疫系統(tǒng)的非正常反應，或者會令一些細菌更快地產(chǎn)生耐藥性或者使耐藥性大幅增強。相信未來隨著科學研究逐漸進步，會出現(xiàn)符合人類需求的手段對基因編輯技術(shù)有更加深入的探究。

參考文獻

[1] 李君，張毅，陳坤玲，等.CRISPR/Cas系統(tǒng)：RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J].遺傳，2013，35（11）：1265-1273.

[2] 劉思也，夏海濱.一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因組靶向修飾技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2013，33（10）：117-123.

[3] 俞珺瑤，杜華平.CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究進展及應用[J].生物技術(shù)通訊，2018，29（03）：422-429.

[4] 康峰，盧勝明，張海峰.CRISPR-Cas系統(tǒng)在生物學研究中的應用[J].實驗動物科學，2014，31（4）：54-58.

[5] 吳彩云，羅秉輪，孫玉強.基因組編輯新技術(shù)：CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物基因組學中的研究進展[J].植物生理學報，2015，51（12）：2063-2069.