白樺三萜提取、檢測和積累影響因素研究進展

姜樹忠

(遼寧省森林經(jīng)營研究所，遼寧 丹東 118002)

白樺Betulaplatyphylla又稱為臭樺、樺木，為樺木科Betulaceae樺木屬Betula植物[1]。白樺分布廣泛，北至俄羅斯遠東及東西伯利亞地區(qū)，南至我國云南，東至日本和朝鮮，西至新疆和西藏太昭，在我國白樺主要分布在東北大小興安嶺、長白山、完達山等地區(qū)[2-6]。白樺是重要的落葉喬木樹種，適應(yīng)性強，抗寒、喜光、喜酸性土壤、耐貧瘠，天然更新快，生長快，常為采伐跡地和火燒跡地的先鋒樹種[7-11]。白樺具有重要的生態(tài)價值、經(jīng)濟價值和藥用價值。白樺木材光滑潔白，紋理細致，常為家具、礦柱、枕木、工藝品、造紙業(yè)、餐飲業(yè)等提供原料，大徑級白樺還是重要的航空膠合板原料，樹皮可做栲膠，汁液可做飲料[12-17]。白樺樹皮組成成分復(fù)雜，藥理活性多樣，樹皮中含有白樺脂酸、齊墩果酸和白樺脂醇等三萜類化合物[18]，此類物質(zhì)具有重要的藥用價值，據(jù)《本草綱目》中記載，白樺樹皮可用于治療疥瘡、黃疸、乳癰等疾病[19-21]。從20世紀初，現(xiàn)代醫(yī)學證明，三萜物質(zhì)在消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降血脂、清熱利濕等方面效果顯著[22-24]。經(jīng)過大量研究，科研人員發(fā)現(xiàn)三萜化合物中的白樺脂酸作為生物抑制劑在對抗癌細胞和HIV病毒時還具有高效低毒的特點[25-26]，因此三萜類化合物在醫(yī)藥研究中有巨大潛力，值得深入研究。

三萜類化合物目前通過生物提取和人工合成的方式獲得，現(xiàn)在主要以生物提取為主。目前研究中，三萜化合物的提取、分離和檢測方式眾多，效率也不同。三萜化合物因為結(jié)構(gòu)復(fù)雜，極性相似，不易分離提純，而應(yīng)用中需求量大，要求純度較高。三萜化合物雖然廣泛存在于自然界大多數(shù)植物中，但含量極低。目前研究發(fā)現(xiàn)，植物中白樺的三萜化合物含量相對較高，有利于提取。人工化學合成方式理論上可行，但是三萜類化合物結(jié)構(gòu)太過復(fù)雜，目前還未完全弄清三萜化合物合成具體方式，化學合成效率低，成本高[27]，無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。由此可見改進提取方式、提升原料含量和人工合成都急需進一步研究，達到提高三萜化合物生產(chǎn)效率的目的，從而提高三萜化合物在醫(yī)藥研究和其他相關(guān)的科學研究中的原料應(yīng)用保障。

1 白樺三萜概況

白樺三萜(Triterpenes ofBetulaplatyphylla,TBP)主要包括白樺脂醇(Betulin,C30H50O2)、白樺脂酸(Betulinic acid，C30H48O3)[28]和齊墩果酸(Oleanolic acid，C30H48O3)等化合物。白樺脂醇和白樺脂酸都屬于羽扇豆烷型的五環(huán)三萜類化合物，齊墩果酸屬于齊墩果烷型的五環(huán)三萜類化合物，都是十分重要的天然次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于各種植物中，且白樺中的三萜化合物含量普遍高于其他植物，因此白樺是白樺三萜的主要提取原料。

白樺脂醇別名樺木醇和樺木腦，于1788年被Lowit在白樺中發(fā)現(xiàn)和分離出來，1952年才被最終確定化學結(jié)構(gòu)。白樺脂醇溶于乙醇、苯、乙醚和氯仿等溶劑，微溶于水。白樺脂醇在白樺樹皮中含量最高，為樹皮干重的10%～34%[29]，白樺的種源類型、樹齡和生長環(huán)境都對白樺脂醇含量產(chǎn)生顯著影響。

白樺脂酸又叫白樺酸和樺木酸，在白樺、鐵刀木、酸棗、大葉胡枝子和杜仲等植物中都有發(fā)現(xiàn)。樺木酸為無色透明結(jié)晶，能溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機溶劑，熔點為316 ℃[30]。白樺酸在白樺樹皮中的含量約為樹皮干重的0.025%，雖然天然含量低，但可由白樺脂醇經(jīng)氧化、還原兩步反應(yīng)得到。1994年Fujioka等發(fā)現(xiàn)白樺脂酸可以抑制HIV病毒復(fù)制和有選擇性地抑制黑色素瘤細胞生長，之后越來越受到國內(nèi)外廣大科研人員的關(guān)注。大量研究證明其藥理活性多樣，高效低毒，作用機制不同于常規(guī)藥物，在治療癌癥、降脂、抗病毒、抗艾滋病等方面有望研究出新型藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景[31-32]。

2 白樺三萜的提取、純化和檢測

2.1 白樺三萜的提取與純化

目前主要提取方式為索氏提取法[33]、超聲波醇提法、氯仿浸提法、回流法、超臨界萃取[34]和亞臨界提取法等。胡祥正等[35-36]使用索氏提取法，確定乙醇作為提取劑的最佳固液比(g∶mL)為0.083，抽提時間6 h，再用異丙醇和乙醇作為溶劑，通過兩步重結(jié)晶純化樺木醇，最終產(chǎn)率為19.8%，純度98%。范桂枝等[37]以白樺為材料對回流法、索氏提取法、超聲波醇提法和氯仿浸提法提取白樺脂醇進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索氏提取法和超聲波醇提法提取效率較高。李影等[38]通過比較不同的提取方法和不同的純化方法，獲得了白樺脂醇提取和純化的最佳方法，使用回流法和重結(jié)晶法，使重結(jié)晶產(chǎn)率達到38%，純度達到99.81%。馬博玉等[39]以白樺樹皮為原料，使用液泛提取設(shè)備，確定了連續(xù)提取白樺脂醇的最佳參數(shù)，提取率為90.39%，純度為89.12%。張靜等[40]使用亞臨界提取法對白樺脂醇提取也得到了較高的提取率。詹亞光等[41]在優(yōu)化白樺愈傷組織提取三萜化合物條件的研究中使用分光光度計法測定總?cè)坪堪l(fā)現(xiàn)，此方法測總?cè)品€(wěn)定、方便且重現(xiàn)性好，提取溫度不同會導致提取結(jié)果發(fā)生變化，提取最佳溫度為40 ℃。綜上所述，三萜化合物的提取和純化方法多種多樣，目前超聲波醇提法效果較好，使用廣泛；重結(jié)晶法的純化效果顯著，但沒有能應(yīng)用于工業(yè)化大量生產(chǎn)白樺三萜的方式，因此應(yīng)找到一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)且效率高的提取和純化方式。

2.2 白樺三萜的檢測

三萜化合物經(jīng)過提取后的檢測工作是評價提取純化方式和評價樣品中三萜化合物含量的重要工作，因此測定方法的準確性和可操作性都極為重要。目前檢測三萜化合物的主要方式為高效液相色譜法、氣相色譜法、高效毛細管電泳法和比色法。張澤等[42]使用高效液相色譜法測定白樺脂醇的含量，以C18色譜柱，流動相為甲醇∶水(88∶12)，紫外檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，柱壓6.4 MPa的條件進行檢測，結(jié)果顯示線性范圍為15.0～300.0 μg，平均回收率為93.93%，與氣相色譜法和比色法相比，此方法更準確和簡便。趙國玲[43]建立了一種能同時檢測白樺脂醇和白樺脂酸含量的方法，在C18反應(yīng)柱，流動相為乙腈∶水(86∶14)，流速1.0 mL·min-1，進樣20 mL的條件測定，此方法結(jié)果準確度高，R2均在0.99以上，能在20 min內(nèi)完成兩種物質(zhì)的檢測。于有強等[44]利用高效液相色譜法建立了能同時檢測白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的方法，以C18色譜柱，流動相甲醇∶水(91∶1)，流速0.6 mL·min-1，210 nm紫外檢測波長，20 μL進樣量，結(jié)果顯示R2在0.999 8以上，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好。譚朝陽等[45]使用高效液相色譜法測定齊墩果酸，結(jié)果有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.69%。孫宏等[46]使用分光光度法對白樺樹皮的三萜化合物總量進行分析，結(jié)果顯示精密度RSD為2.16%，回收率為96.16%～98.85%。方玉棟、祁逸梅等[47-48]使用氣相色譜法對三萜化合物進行測定，此方法對樣品衍生化后才能測定，測量難度大。劉海興等[49]使用毛細管電泳法有效地測定了石楠葉中齊墩果酸和熊果酸含量，平均回收率分別達到102%和104%。從大量研究可以看出，現(xiàn)在普遍用高效液相色譜法檢測三萜化合物，此方法方便且準確度高，易重復(fù)，能有效測定三萜化合物含量，缺點是液相色譜法檢測成本高，樣品數(shù)量多時費時費力且價格較高。

3 白樺樹中三萜積累的研究

白樺產(chǎn)生三萜化合物是植物為了適應(yīng)環(huán)境而長期進化的結(jié)果，因此積累的量不僅與遺傳因素有關(guān)，還與環(huán)境因素有關(guān)。范桂枝等[37]以不同種源的白樺為研究材料，測定不同種源白樺不同部位的白樺脂醇含量發(fā)現(xiàn)，同齡樹的樹高、胸徑對白樺醇的影響不顯著，不同種源間的含量差異顯著，白樺脂醇的含量不僅受到種源和遺傳因素的影響，同時也受到地理環(huán)境和氣候的影響，在白樺中分布含量為外皮>枝皮>內(nèi)皮>芽>葉>根>花粉。王倩[50]在研究白樺樹皮中三萜化合物分布時發(fā)現(xiàn)不同的三萜化合物在不同高度含量差異不顯著，樹皮最外側(cè)含量最高，內(nèi)側(cè)略有降低，差異不顯著，樹皮內(nèi)的三萜物質(zhì)含量隨季節(jié)的變化不顯著。李新宇等[51]以白樺幼樹為材料，研究不同光質(zhì)和光強對三萜積累的影響，發(fā)現(xiàn)紅、黃、藍、綠4種光均降低了莖外皮的白樺脂醇和齊墩果酸含量；藍光處理顯著提高葉片白樺脂醇含量，綠光提高葉片齊墩果酸含量，白樺脂醇和齊墩果酸含量變化顯著受到了季節(jié)的調(diào)控。李春曉等[52]以白樺幼樹為材料，研究茉莉酸甲酯(MeJA)、水分和氮肥處理對白樺三萜物質(zhì)積累的影響和白樺三萜的積累規(guī)律，發(fā)現(xiàn)幼樹總?cè)圃诟ぷ钌伲~片和莖皮中最多，根皮和莖皮的總?cè)品e累高峰為7月份和8月份，葉片為6月份；干旱脅迫在6月和7月分別有利于葉和莖積累三萜物質(zhì)，干旱不利于根中三萜積累；6-7月施氮肥有利于莖中三萜積累，7-10月施氮肥或MeJA都有利于葉和根積累三萜物質(zhì)。

4 不同物質(zhì)對白樺三萜積累的影響

白樺三萜是植物的次生代謝物，含量較低。次生代謝物通常需要特殊的物質(zhì)或環(huán)境刺激才能加快合成，不同植物中不同的次生代謝物往往需要不同的物質(zhì)刺激產(chǎn)生，通過白樺組織培養(yǎng)和白樺細胞懸浮培養(yǎng)可以研究不同物質(zhì)對白樺三萜積累的影響。

4.1 培養(yǎng)基種類和生長調(diào)節(jié)劑的影響

王博等[53]以白樺優(yōu)樹腋芽為外植體誘導產(chǎn)生愈傷組織，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中NO3-含量略高于NH4+含量及培養(yǎng)基含豐富的有機物有利于白樺三萜積累，低濃度的6-BA和TDZ有利于三萜積累，過高或過低濃度的6-BA和NAA組合都不利于白樺三萜積累，白樺三萜的積累和細胞分裂生長不是同步進行。尹靜等[54]研究組培苗愈傷組織中三萜化合物分布和含量時發(fā)現(xiàn)，白樺細胞懸浮培養(yǎng)可以得到白樺脂醇和齊墩果酸，培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)與細胞的全面接觸和細胞間物質(zhì)的傳遞，有利于三萜化合物積累。范桂枝等[55]以白樺懸浮系為材料，通過試驗發(fā)現(xiàn)B5培養(yǎng)基和20～30 g·L-1FW的接種量有利于白樺懸浮細胞的生長和三萜積累，在培養(yǎng)過程中，細胞生物量和三萜的積累量成正相關(guān)，三萜的產(chǎn)量隨生物量的增加表現(xiàn)為增長趨勢，培養(yǎng)液中的成分降低也會限制細胞增殖和三萜的合成。

4.2 光照的影響

范桂枝等[56]以白樺組培苗莖段為材料，研究了不同光質(zhì)和光周期對白樺三萜積累的影響，發(fā)現(xiàn)不同的光質(zhì)和光周期都對三萜化合物積累有調(diào)節(jié)作用。王博[57]以白樺組培苗為材料，通過誘導白樺產(chǎn)生愈傷組織，對愈傷組織進行液體懸浮培養(yǎng)和固體組織培養(yǎng)，研究白樺三萜在愈傷組織中的代謝調(diào)控發(fā)現(xiàn)，以藍色光質(zhì)，強光照，蔗糖濃度為30 mg·L-1，0.8 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA，IS為基本培養(yǎng)基是最適合白樺三萜產(chǎn)生的固體培養(yǎng)基，藍光對白樺愈傷組織積累白樺三萜有利；懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)白樺三萜的效果比固體培養(yǎng)基更好，最佳的懸浮培養(yǎng)條件為B5培養(yǎng)基，添加0.4 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1TDZ，接種量10 g·L-1(FW)。

4.3 外物刺激的影響

姜洋等[58]研究一氧化碳(CO)對白樺懸浮細胞產(chǎn)生三萜化合物的影響時發(fā)現(xiàn)，CO對白樺懸浮細胞產(chǎn)生三萜物質(zhì)有促進作用。黃雅婷等[59]研究硝普鈉(SNP)對白樺懸浮細胞積累白樺脂醇的影響時發(fā)現(xiàn)，SNP分別和K+或Ca2+互作可以更好地促進白樺懸浮細胞積累白樺醇。孫美玲等[60]以白樺懸浮細胞為材料，研究過氧化氫(H2O2)介導真菌誘導子促進白樺脂醇積累時發(fā)現(xiàn)，外源H2O2降低細胞活力和干物質(zhì)積累，提高了白樺酯醇的含量。王艷等[61]在研究鈣離子介導水楊酸(SA)誘導白樺懸浮細胞三萜合成的作用時發(fā)現(xiàn)，水楊酸能誘導白樺懸浮細胞產(chǎn)生三萜化合物，在鈣離子的作用下，水楊酸的誘導效果被加強。常志凱等[62]研究高溫脅迫對白樺懸浮細胞積累三萜化合物的影響，確定了利用高溫脅迫促進白樺懸浮細胞的最佳溫度為50 ℃，脅迫2 h后24 h取樣。翟俏麗等[63]使用真菌誘導子促進了白樺懸浮細胞中三萜的積累。

5 小結(jié)與展望

5.1 小 結(jié)

目前，白樺三萜經(jīng)過多年的研究取得了一定的進展。①白樺三萜的提取、純化和檢測方面，眾多學者研究了多種方法，以超聲波醇提法為主要的三萜提取方法，此方法相對簡便且效率高；白樺三萜的純化主要用重結(jié)晶法，此方法得到的純化產(chǎn)物純度較高；白樺三萜的含量檢測主要為高效液相色譜法，此方法能有效分離檢測不同三萜化合物的含量，檢測精確度高，可重復(fù)性強。②白樺三萜在白樺中分布積累的特點，樹中大部分都有分布，樹干外皮三萜含量最高，花粉中最少；白樺三萜的含量不受樹高和莖粗的影響；種源、樹齡和季節(jié)會影響三萜含量，但具體原因還不清楚，可能與季節(jié)變化的溫度、光照、降雨量等發(fā)生變化有關(guān)；通過水分、氮肥、茉莉酸甲酯等物質(zhì)可調(diào)控白樺三萜的積累。③通過組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)白樺愈傷組織可以產(chǎn)生三萜化合物，且改變培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)條件都可調(diào)控三萜化合物的積累。④通過固體培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，光質(zhì)、光強、溫度等環(huán)境因子和水楊酸、H2O2、CO、真菌誘導子、SNP、K+、Ca2+等多種物質(zhì)都對白樺三萜的積累有影響，通過適當?shù)呐囵B(yǎng)條件可有效提升白樺三萜的產(chǎn)量。

5.2 展 望

通過大量的研究，白樺可以通過適當?shù)姆绞教嵘飘a(chǎn)量，但是提升的量不足以改變產(chǎn)量低的現(xiàn)狀。白樺生長周期長，通過樹皮獲取三萜物質(zhì)會破壞大量白樺資源。利用細胞懸浮技術(shù)培養(yǎng)白樺細胞，研究三萜物質(zhì)的產(chǎn)生和積累效率更高、周期短，能節(jié)省大量人力物力。目前可以繼續(xù)以細胞懸浮培養(yǎng)的方式研究白樺三萜在細胞中合成和積累的機理，找到能引導細胞大量合成白樺三萜的方式，結(jié)合基因工程技術(shù)，最終獲得專產(chǎn)三萜物質(zhì)的細胞，使三萜物質(zhì)能工業(yè)化大量生產(chǎn)，為三萜化合物的應(yīng)用研究提供保障，最終為人類的疾病治療提供服務(wù)。