納米銀對河口潮灘硝酸鹽異化還原成銨過程的影響

張夢霞 鄭艷玲 尹國宇 董宏坡 韓平 高娟 劉程 常永凱 劉敏 侯立軍

摘要：人類活動會導致納米銀（AgNPs）毒性污染物在河口海岸環(huán)境富集，但AgNPs賦存和累積對河口氮轉(zhuǎn)化過程的影響尚不清楚，為此，以長江口作為研究區(qū)域，對不同粒徑（10nm、30nm和100nm）及不同濃度（0.1mg/L、5mg/L和10mg/L）的AgNPs進行暴露實驗，探究AgNPs對河口潮灘硝酸鹽異化還原成銨（DNRA）的影響，結(jié)果表明，添加AgNPs對不同鹽度沉積物DNRA速率均產(chǎn)生一定程度的抑制效應，但其抑制率并沒有隨時間增長而明顯增大，受沉積物理化性質(zhì)的影響，AgNPs對中鹽度（8.0%）沉積物DNRA速率抑制效應總體上高于其余鹽度沉積物，沉積物環(huán)境中AgNPs的粒徑及濃度均是影響其毒性的重要因素：當濃度不超過5mg/L時，10nm粒徑AgNPs毒性大于30nm和100nm粒徑，其在不同鹽度沉積物中抑制率最高達16.03%、20.27%和15.36%;但當AgNPs濃度為10mg/L時，30nm和100nm粒徑的AgNPs對DNRA速率抑制程度明顯增大，毒性效應大于10nm粒徑AgNPs，不同鹽度沉積物中最大抑制率分別為17.48%、33.18%和26.45%，AgNPs釋放的Ag+濃度與DNRA速率的抑制率未存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（p>0.05），反映AgNPs釋放的Ag⁺對DNRA存在一定的抑制作用，但并不能完全解釋AgNPs的毒性作用特征，研究結(jié)果對于客觀評價金屬納米材料對河口氮循環(huán)的潛在影響具有重要科學意義。

關(guān)鍵詞：納米銀：硝酸鹽異化還原為銨;粒徑;鹽度：長江口

中圖分類號：X171.1文獻標志碼：A DOI：10.3969/j，issn，1000-5641.201941005

0引言

氮素是河口生態(tài)系統(tǒng)重要的生源要素之一，近年來，隨著工農(nóng)業(yè)活動的發(fā)展，大量活性氮（硝酸鹽為主）的輸入增加了河口地區(qū)氮負荷，造成諸如有害藻類赤潮暴發(fā)和季節(jié)性低氧區(qū)等一系列生態(tài)環(huán)境問題，氮素遷移轉(zhuǎn)化過程研究已然成為當今國際河口海岸科學研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點問題，硝酸鹽異化還原成銨（DNRA）主要指厭氧微生物將硝態(tài)氮異化還原為銨鹽的過程，在調(diào)控河口濕地氮的歸宿中扮演重要作用，因此，關(guān)于河口濕地DNRA過程的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。

納米銀（AgNPs）是指粒徑在1～100nm之間的單質(zhì)銀粒子，由于良好的光電、催化、超導性能和殺菌消毒活性，AgNPs被廣泛應用于眾多領(lǐng)域和消費產(chǎn)品中，全世界含有AgNPs的商品種類超過400種，目前，全球每年AgNPs的產(chǎn)量大約為500t，預測至2020年AgNPs的年產(chǎn)量將達到1216t，AgNPs的大量使用使其不斷進入環(huán)境中并產(chǎn)生累積，在有氧條件下，AgNPs極易被氧化并釋放出Ag+，而Ag是具有高毒性的重金屬之一，會對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成潛在威脅，有學者研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs（10mg/L）進入序批式活性污泥（sBR）水處理系統(tǒng)后，其抗菌性會抑制活性污泥中微生物生長，影響脫氮和除磷相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)，削弱系統(tǒng)脫氮除磷效果，Liang等在污水處理系統(tǒng)中連續(xù)12h通人AgNPs（1mg/L），發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中氨氮和亞硝酸鹽不斷積累，并抑制了氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌和硝化菌屬的數(shù)量，且抑制作用持續(xù)時間長達1個月以上，張汝嘉等采用濃度0.12～4.82mg/LAgNPs懸濁溶液也證實了其對氨氧化細菌有顯著的抑制作用，此外，許多研究還關(guān)注了AgNPs粒徑與毒性效應的關(guān)系，并指出不同粒徑AgNPs對硝化細菌的影響有所不同，AgNPs毒性對不同鹽度的響應也有所差異，當AgNPs進入復雜的河口沉積物環(huán)境中，耦合多變的理化性質(zhì)會影響其毒性作用，目前，關(guān)于環(huán)境中AgNPs毒理效應和致毒機制研究還處于探索階段，而且AgNPs對氮循環(huán)過程影響的研究大多集中于硝化和反硝化過程及相關(guān)的微生物活性，對DNRA過程的影響還鮮見報道，

AgNPs大規(guī)模商業(yè)化應用創(chuàng)造了大量經(jīng)濟效益的同時，也通過各種途徑進入了環(huán)境中，其安全性受到國內(nèi)外眾多學者的廣泛關(guān)注，河口潮灘濕地是海陸交互的重要過渡地帶，也是全球氮庫的重要組成部分，此外，河口地區(qū)又是人類活動高度密集的地區(qū)之一，人類活動對河口地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成很大影響，其中，長江口位于中國經(jīng)濟最發(fā)達，人口密度最大的區(qū)域，氮負荷增強給長江口及近岸生態(tài)系統(tǒng)帶來巨大的影響，因此研究AgNPs對長江口DNRA過程的影響也就顯得尤為重要，基于此，以長江口為研究區(qū)域，分別選取3個不同鹽度濕地沉積物為研究對象，探討不同粒徑及濃度的AgNPs對DNRA過程的影響，以期為評價金屬納米材料對河口氮循環(huán)的潛在影響提供科學借鑒，

1材料與方法

1.1樣品采集及實驗室預處理

以長江口為研究區(qū)域，沿鹽度梯度，選取瀏河口（LHK，鹽度為0.2%0），東海農(nóng)場（DHNC，鹽度為8.0%0）和金山（Js，鹽度為20%0）為采樣點（見圖1），于2017年7月，分別在3個采樣點采集深約10cm，直徑為7cm的沉積物柱狀樣，并現(xiàn)場測定站位潮水鹽度，樣品采集完后于4℃培養(yǎng)箱保存并在2h內(nèi)運回實驗室，在實驗室內(nèi)，將沉積物柱狀樣置于培養(yǎng)箱內(nèi)，使用蠕動泵持續(xù)通人含不同粒徑AgNPs的人工海水（鹽度與各采樣點潮水相同，含接近環(huán)境背景的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，約為：NaN0380umol/L，NH4CI30umol/L和KH2PO46umol/L），AgNPs濃度設(shè)置為0mg/L、0.1mg/L、5mg/L和10mg/L的濃度梯度，各樣點均分為10個處理組，包括空白組（0mg/L AgNPs），10nm粒徑組（分別為0.1mg/L、5mg/L和10mg/L AgNPs），30nm粒徑組（分別為0.1mg/L、5mg/L和10mg/LAgNPs）和100nm粒徑組（分別為0.1mg/L、5mg/L和10mg/L AgNPs），每個處理組設(shè)置3個重復，3種粒徑AgNPs均購自蘇州冷石納米材料科技有限公司，全程實驗溫度控制在20℃，培養(yǎng)30d，并且分別在實驗的第1、6、10、15和30天采集表層沉積物樣品，用于分析潛在的DNRA速率，并測定沉積物理化性質(zhì)和AgNPs釋放的Ag+濃度。

1.2潛在DNRA速率的測定

基于泥漿培養(yǎng)和同位素示蹤技術(shù)測定沉積物潛在DNRA速率，首先將沉積物樣品和相應鹽度的人工海水按照1：7的比例充分攪拌成均質(zhì)泥漿，通人氦氣曝氣30min，以排凈泥漿中的氧氣，將曝氣后的泥漿轉(zhuǎn)移至一系列12mL頂空瓶中，進行24h預培養(yǎng)以消耗背景硝態(tài)氮（N03）和亞硝態(tài)氮（N02^-），預培養(yǎng)結(jié)束后，向每個頂空瓶中加入15N03^-，震蕩均勻，然后將所有的頂空瓶分為2組，一組作為起始樣品加入200ul飽和ZnCl2溶液抑制劑，另一組設(shè)置為終止樣，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8h后加入抑制劑，隨后，利用次溴酸氧化與膜人口質(zhì)譜儀（MIMS）聯(lián)用技術(shù)測定DNRA過程中¹⁵NH4⁺的產(chǎn)生量，并依據(jù)以下公式計算潛在DNRA速率：

1.3理化參數(shù)分析

沉積物銨鹽（NH4⁺）、亞硝酸鹽（NO2^-）和硝酸鹽（NO3^-）用2mol·L^-3KCI浸提后，利用Skalar營養(yǎng)鹽自動分析儀（sAN plus）分析測定，硫化物的測定是先將沉積物加入1mol·L^-1HCl酸化，酸化后沉積物中硫化物轉(zhuǎn)化為硫化氫氣體，將產(chǎn)生的硫化氫氣體收集通入到顯色溶液對氨基二甲基苯胺中，顯色后利用分光光度計測定，沉積物中有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法進行測量，沉積物粒度采用Ls 13320粒度儀進行測定，沉積物含水率采用烘干法測定，Ag+濃度的測定，是將表層沉積物孔隙水加入Amicon Ultra-15超濾管（3kDa，Millipore）中在14000r/min下離心40min，濾出液經(jīng)2%硝酸酸化后用ICP-MS（Agilent 7700inductively coupled plasma mass spectrometer）進行檢測，以上所有理化因子的測定均設(shè)置3個平行，取平均值作為最終測定結(jié)果，

1.4統(tǒng)計分析方法

測定結(jié)果與環(huán)境因素的相關(guān)性分析及實驗數(shù)據(jù)的多因素方差分析用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件完成，顯著水平設(shè)定為p<0.05.文中插圖用Origin 9.0制作。

2結(jié)果與分析

2.1Ag+濃度的變化

為期30d培養(yǎng)，LHK、DHNC和Js不同粒徑AgNPs處理中Ag⁺釋放濃度分別介于0.91～40ug/L、10～150ug/L和10～390ug/L（見圖2），其中，低鹽度樣點LHK的Ag⁺釋放濃度總體上低于中鹽度樣點DHNC和高鹽度樣點Js，此外，在培養(yǎng)初期（第1天），各站點10am相較于30am和100am呈現(xiàn)出更多的Ag釋放，但隨著培養(yǎng)時間延長，其Ag⁺釋放濃度總體上無顯著增加，而30am和100am的Ag+釋放濃度隨著培養(yǎng)時間延長而增加，釋放總量更大，且在DHNC和Js表現(xiàn)較為明顯（見圖2）。

多因素方差分析結(jié)果顯示（見表2），沉積物鹽度、AgNPs粒徑、AgNPs濃度的交互作用對DNRA速率變化率影響不顯著，而AgNPs粒徑、AgNPs濃度交互作用對DNRA速率變化率具有顯著影響，高濃度（10mg/L和5mg/L）AgNPs處理組的DNRA抑制率顯著高于低濃度（0.1mg/L）AgNPs處理組（分別介于-33.18%～0.05%、^-20.71%～7.25%、-7.52%～7.12%），濃度≤5mg/L時，10nmAgNPs處理組的DNRA抑制率顯著高于30BE和100nm AgNPs處理組（p<0.05），其在LHK、DHNC和Js不同鹽度站位沉積物中最大抑制率分別為16.03%、20.27%和15.36%，而AgNPs濃度為10mg/L時，大粒徑（30BE和100BE）AgNPs對DNRA速率抑制率更高，不同鹽度站位沉積物中抑制率最高達17.48%、33.18%和26.45%，說明相同鹽度條件下，AgNPs毒性取決于其粒徑大小和濃度，此外，AgNPs濃度與沉積物鹽度的交互作用對DNRA速率變化率也具有顯著影響，不同鹽度站位沉積物對添加AgNPs的響應分別介于-17.48%～7.25%、-33.18%～6.89%和^-26.45%～0.99%，且不同濃度AgNPs均在中鹽度站位DHNC具有較大的DNRA速率抑制率。

3討論

本研究探討了不同粒徑及不同濃度AgNPs添加對河口沉積物DNRA過程的影響，研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs處理下3個不同鹽度站位DNRA速率均受到不同程度的抑制（見圖4），已有大量研究證實了AgNPs對硝化及反硝化過程的毒性作用，1mg/L的AgNPs可以導致硝化細菌數(shù)量減少，削減60%的硝化速率，Choi和Hu研究表明，1mg/L的AgNPs對實驗室富集培養(yǎng)硝化細菌的硝化抑制率達到70%，且其EC50（引起50%硝化抑制率的AgNPs濃度）為0.14mg/L，較低的AgNPs濃度（小于1mg/L）即可以抑制反硝化模式菌株施氏假單胞菌50%的生物活性12引，但近期有研究發(fā)現(xiàn)，在土壤環(huán)境中AgNPs毒性會顯著降低，Liu等采用不同濃度和種類的AgNPs溶液探究其對太湖沉積物中反硝化微生物的影響，實驗結(jié)果顯示，1mg/L的AgNPs在8h培養(yǎng)周期內(nèi)對太湖沉積物反硝化過程沒有顯著影響，另外，VandeVoort等研究中也出現(xiàn)類似結(jié)果，分析認為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是AgNPs進入土壤環(huán)境中后，通過和環(huán)境中無機陰離子（例如C1等）以及其他常見配體的絡(luò)合，導致AgNPs及其釋放的Ag+的生物可利用度降低，毒性降低，目前，關(guān)于AgNPs對DNRA過程的影響還鮮有報道，關(guān)于低濃度長期暴露條件下AgNPs對河口沉積物DNRA速率影響情況所知甚少，本研究結(jié)果表明，30d實驗周期內(nèi)0.1mg/L的AgNPs對河口沉積物DNRA速率抑制作用最高達7.52%，而5mg/L的AgNPs即可對沉積物DNRA過程產(chǎn)生明顯抑制效應，最大抑制率為20.27%（產(chǎn)生于中鹽度沉積物10nm粒徑AgNPs），一定程度上說明長期暴露下環(huán)境中不斷累積的AgNPs會帶來潛在生態(tài)風險，此外，Chen等研究發(fā)現(xiàn)，0.5mg/L AgNPs顯著影響了活性污泥中反硝化功能微生物群落結(jié)構(gòu)，10mg/L AgNPs使得nirK型及nosZ型反硝化微生物群落組成中副球菌（Paracoccu8）的相對豐度明顯降低，白潔等探究了不同濃度AgNPs對河口區(qū)沉積物反硝化酶活性及功能基因豐度的影響，結(jié)果表明AgNPs對沉積物中還原酶活性及功能基因narG和nirS的基因豐度均具有濃度抑制效應，且AgNPs主要是通過對narG基因豐度的抑制來實現(xiàn)對N03還原過程的影響，而對N02還原酶的抑制程度則明顯大于nirS基因豐度，以此抑制NO2還原過程，鑒于近年來納米材料的廣泛使用，AgNPs潛在的環(huán)境危害不容忽視，仍需要在生態(tài)系統(tǒng)，群落，以及基因蛋白等不同層次上探討AgNPs對河口區(qū)氮循環(huán)微生物的影響和毒性作用機制。

然而，在培養(yǎng)初期還發(fā)現(xiàn)AgNPs添加對DNRA過程產(chǎn)生了一定的促進作用，這可能與AgNPs的毒物興奮效應有關(guān)，一定濃度范圍內(nèi)的AgNPs可能會刺激微生物的生長，加快DNRA反應速率，有研究指出，低劑量的AgNPs可提高大腸桿菌活性，其他納米材料（如ZnO和Ti02）的亞致死水平也會產(chǎn)生刺激作用，但這種刺激是否可以通過加快微生物呼吸速率并獲得更多能量，以有效地修復損傷和應對AgNPs所帶來的脅迫，這仍有待確定。

根據(jù)AgNPs釋放的Ag+濃度變化規(guī)律（見圖2）可知，隨著鹽度的增加，釋放的Ag+濃度總體上也趨于增加，這可能是因為環(huán)境配體包括C1、S2等可以與AgNPs釋放的Ag+反應，使得AgNPs釋放Ag+速率隨著CI/Ag的增加而增大，一般認為AgNPs的毒性與其釋放的Ag+濃度有很大關(guān)系，釋放的Ag+可以產(chǎn)生活性氧（ROS）、破壞細胞膜完整性、與細胞內(nèi)含硫蛋白結(jié)合、引起DNA損傷和功能蛋白質(zhì)失活等，AgNPs在較高鹽度站位Js釋放的Ag+濃度相對較高，根據(jù)前人研究結(jié)果，AgNPs對Js的DNRA速率的抑制率應該最為顯著，然而，本研究實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管沉積物鹽度對DNRA速率變化率影響不顯著（p>0.05.見表2），但相比較于LHK和Js站位，AgNPs對中鹽度站位DHNC的DNRA速率抑制率總體相對較高（見圖4），這種現(xiàn)象可能與Js和DHNC站位不同理化性質(zhì)的差異有關(guān)，有學者研究指出在硫化物（h2s、s^2-）或單質(zhì)s的氧化驅(qū)動下，通過無機化能自養(yǎng)硫細菌氧化，將NO3還原為NH4⁺，可以進行化能自養(yǎng)型的DNRA過程，本研究中，Js站位硫化物含量顯著高于DHNC站位，且隨培養(yǎng)時間延長而不斷降低，這表明在培養(yǎng)過程中硫化物被不斷消耗，可能與自養(yǎng)硫細菌消耗硫化物耦合進行DNRA過程有關(guān)，因此在Js站位相對富硫的環(huán)境中，充足的硫化物使得自養(yǎng)硫細菌更易于抵抗AgNPs的毒性，DNRA速率與硫化物顯著相關(guān)關(guān)系（p=0.013.r=0.105）也證實了這一結(jié)果（見表1），研究表明AgNPs硫化也會使其毒性降低，另外，Beddow等實驗中發(fā)現(xiàn)AgNPs在較高鹽度下Zeta電位值明顯小于低鹽度，在高鹽度中AgNPs更容易團聚，團聚后AgNPs毒性明顯降低，這也進一步導致Js站位沉積物DNRA速率受AgNPs毒性抑制作用的降低，

本研究還發(fā)現(xiàn)，AgNPs粒徑對DNRA速率變化率具有顯著影響（p<0.05.見表2），AgNPs濃度≤5mg/L時，與30am和100am相比較，10am粒徑AgNPs對不同鹽度站位沉積物DNRA速率均表現(xiàn)出相對較高的抑制率（見圖4），與大粒徑相比，小粒徑AgNPs更容易穿透生物膜進入細胞內(nèi)，直接攻擊DNA、蛋白質(zhì)或酶，其較大的比表面積生成更多的活性氧（ROS），更容易導致細胞損傷，納米級粒徑的量子尺寸效應占主導地位，這可能是導致出現(xiàn)這一結(jié)果的重要原因，然而，當AgNPs濃度為10mg/L時，30nm和100nm粒徑的AgNPs對DNRA速率抑制率顯著增大，這與大粒徑AgNPs釋放的Ag+濃度明顯高于10nm粒徑AgNPs有關(guān)，AgNPs釋放的Ag+毒性作用優(yōu)于其粒徑效應，且隨AgNPs濃度增加，小粒徑AgNPs團聚更嚴重其粒徑的優(yōu)勢被削弱，對DNRA速率抑制程度降低，目前關(guān)于AgNPs粒徑與其毒性作用的研究還未有統(tǒng)一的結(jié)論，盡管大多數(shù)的研究表明AgNPs毒性與其粒徑成反比關(guān)系，但仍有部分研究認為金屬納米顆粒的毒性與其尺寸沒有依賴關(guān)系，且不同環(huán)境及微生物菌群也會影響AgNPs粒徑毒性。

本研究中未發(fā)現(xiàn)AgNPs釋放的Ag⁺濃度和DNRA速率抑制率間存在顯著相關(guān)關(guān)系（p>0.05），且10mg/L AgNPs處理與5mg/L處理對DNRA速率抑制程度的差異并不顯著（p>0.05），表明沉積物環(huán)境中AgNPs毒性不能僅僅歸因于Ag+毒性，更可能受釋放的Ag+毒性、納米粒子效應和環(huán)境理化因子的綜合影響，自然環(huán)境中，影響AgNPs毒性效應和環(huán)境行為的因素和過程極其復雜，且AgNPs進入環(huán)境后會通過多種途徑改變其存在形態(tài)，而河口復雜的沉積物環(huán)境加大了AgNPs毒理辨別的復雜性，后續(xù)工作可進一步探究AgNPs對DNRA過程功能基因及菌群結(jié)構(gòu)的影響，以明晰AgNPs對DNRA過程的微生物影響機制。

4結(jié)論

（1）AgNPs對不同鹽度沉積物DNRA速率均產(chǎn)生抑制作用，但其抑制程度并未隨時間延長而明顯增大，AgNPs對沉積物DNRA速率的抑制作用并不僅僅取決于其釋放的Ag+毒性作用。

（2）不同鹽度條件下AgNPs對DNRA速率的影響結(jié)果表明，AgNPs對中鹽度（8.0‰）站位沉積物產(chǎn)生的抑制率相對較高。

（3）沉積物環(huán)境中，AgNPs粒徑、濃度均是影響其毒性的重要因素，相同鹽度下，AgNPs濃度≤5mg/L時，小粒徑AgNPs（10nm）比30nm和100nm粒徑具有更強的毒性，納米粒子效應占主導地位，而當AgNPs濃度為10mg/L時，30nm和100nm粒徑的AgNPs對DNRA速率抑制率顯著增大，AgNPs釋放的Ag+毒性作用優(yōu)于其粒徑效應。