水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌ddPCR 定量方法的建立

馬 丹，魏詠新，李 丹，魏海燕，徐蕾蕊，汪 琦，付溥博，張西萌，曾 靜*

（北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 100026）

創(chuàng)傷弧菌是普遍生存在海洋中的一種細(xì)菌，若生食受該菌污染的海產(chǎn)品（特別是牡蠣），或皮膚傷口接觸存在創(chuàng)傷弧菌的貝類或海水，可在48 h內(nèi)出現(xiàn)感染性休克、皮膚肌肉壞死、膿毒血癥，進(jìn)而引起多臟器功能衰竭，其死亡率高達(dá)50%[1-3]。當(dāng)前評價(jià)水產(chǎn)品安全性的指標(biāo)仍主要依賴大腸菌群等衛(wèi)生指標(biāo)，而這并不能反映創(chuàng)傷弧菌的污染程度。盡管現(xiàn)有法規(guī)并沒有對貝類等水產(chǎn)中的創(chuàng)傷弧菌數(shù)量作出明確的規(guī)定，美國食品藥品監(jiān)督管理局卻支持對捕獲的貝類產(chǎn)品進(jìn)行處理，以減少或去除創(chuàng)傷弧菌，因此，定量方法對于準(zhǔn)確而有效地評估水產(chǎn)脫菌處理措施的有效性十分必要，也有助于相關(guān)部門對水產(chǎn)安全性的監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評估。

目前創(chuàng)傷弧菌的定量檢測仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，如平板計(jì)數(shù)和MPN法[4-5]，需要經(jīng)過過夜培養(yǎng)、選擇性平板分離、生化鑒定、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等復(fù)雜的過程，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且樣品中潛在的其他雜菌有可能會(huì)因過度增殖而給目標(biāo)菌鑒定造成干擾。此外，水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌經(jīng)常以“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)”存在[6]，傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法有效檢測到這部分細(xì)菌[7]，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來，以實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）為代表的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸被廣泛應(yīng)用到創(chuàng)傷弧菌的定量檢測中去[8]。相比較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，real-time PCR快速、簡便、靈敏、特異，然而，該方法仍屬于相對定量檢測，帶有準(zhǔn)確量值的標(biāo)準(zhǔn)品往往難以獲得，而且樣品中核酸擴(kuò)增的抑制成分、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者的技能等都會(huì)直接影響real-time PCR擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量，從而干擾檢測的準(zhǔn)確性[9-10]。

新興的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被認(rèn)為是第3代核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布到10 000～20 000 個(gè)微滴中，使大部分微滴中DNA分子數(shù)量為1或0，然后通過PCR擴(kuò)增和陽性信號的累積讀取陽性反應(yīng)單元數(shù)，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對DNA分子的絕對定量[11-16]。目前該技術(shù)用于微生物的定量分析尚處于起步階段，相關(guān)的研究如臨床樣本類免疫缺陷病毒、惡性胸膜瘤、乙型肝炎病毒、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、沙眼衣原體、產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希氏菌，以及導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)的植物病原菌等[17-23]，鮮見創(chuàng)傷弧菌定量檢測的相關(guān)報(bào)道，且已有研究鮮有涉及水產(chǎn)等食品。由于食品基質(zhì)多富含蛋白、脂肪、果膠等核酸擴(kuò)增抑制成分，背景菌構(gòu)成復(fù)雜且濃度較高，因此，ddPCR對食品中創(chuàng)傷弧菌定量分析的有效性和實(shí)用性尚未可知。本研究旨在建立適用于水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的ddPCR精準(zhǔn)定量檢測技術(shù)，為保障食品安全、開展風(fēng)險(xiǎn)評估等研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共使用107 株菌（表1）：創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1 株、自分離株20 株；其他弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或自分離株66 株；其他食源性致病菌20 株。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 List of experimental strains used in this study

培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；DNA提取試劑盒（貨號：DP302） 天根生化科技有限公司；ddPCR Supermix for Probes（no dUTP） 美國伯樂公司；2×Taqman Universal PCR mastermix 美國ABI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Fr-1iocell恒溫培養(yǎng)箱 德國MMM公司；QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)美國伯樂公司；7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Veriti 96 well Thermal cycler PCR儀 美國ABI公司；nanodrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

弧菌采用3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取純培養(yǎng)后的單菌落到10 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水（alkaline peptone water，APW）中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)18 h，以備梯度稀釋用于檢測。其他食源性致病菌采用營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取純培養(yǎng)后的單菌落到10 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)18 h，以備梯度稀釋用于檢測。

1.3.2 引物探針的設(shè)計(jì)與篩選

為實(shí)現(xiàn)對創(chuàng)傷弧菌的特異性檢測和絕對定量分析，分別選取創(chuàng)傷弧菌具有種屬特異性且高度保守的單拷貝脂蛋白D基因（nplD，GenBank no. AY187681.1）、RNA聚合酶亞單位σ因子S基因（rpoS，GenBank no.AY187681.1）、毒力相關(guān)基因E（vcgE，GenBank no.AY626581.1）和金屬蛋白酶基因（met，GenBank no.U50548.1）作為靶序列，通過NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對，利用Prime Express軟件V3.0（ABI, Foster City, CA, USA）設(shè)計(jì)出4 對引物和探針組合，序列見表2。探針5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記BHQ。引物/探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別利用real-time PCR和ddPCR對創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）基因組DNA進(jìn)行檢測，比較4 組引物探針的熒光信號，并利用表2菌株驗(yàn)證所篩選引物探針的特異性。

表2 ddPCR引物/探針序列Table 2 Sequences of ddPCR primers and probes

1.3.3 基因組DNA提取與超微量分光光度計(jì)測定

利用含3%氯化鈉的APW對創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）的過夜培養(yǎng)菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各稀釋度菌液DNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最終將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中。對提取的核酸用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測定，確保提取核酸的A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，并按下式計(jì)算提取創(chuàng)傷弧菌基因組DNA濃度：

式中：m為超微量分光光度計(jì)測得的核酸質(zhì)量濃度/（ng/μL）；n為細(xì)菌基因組的長度/bp；根據(jù)NCBI上已經(jīng)發(fā)布的創(chuàng)傷弧菌基因組的測序數(shù)據(jù)，其平均長度為4.97×106bp；1.096為在由核酸質(zhì)量濃度換算為拷貝數(shù)時(shí)的常數(shù)。

1.3.4 real-time PCR檢測

20 μL的real-time PCR體系包括：2×Taqman Universal PCR mastermix 10 μL，10 μmol/L的上游、下游引物、探針各1 μL，待測DNA模板2 μL。于7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，50 ℃酶激活2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，進(jìn)而95 ℃變性15 s、60 ℃退火及延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用SDS3.2軟件進(jìn)行分析。以10 倍梯度稀釋純菌液中提取的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)1.3.3節(jié)基因組DNA提取與超微量分光光度計(jì)測定中公式計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)Ct值為縱坐標(biāo)，繪制real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程和real-time PCR檢測Ct值計(jì)算未知樣品的靶基因拷貝數(shù)。

1.3.5 ddPCR檢測

20 μL的ddPCR體系包括10 μL ddPCRTMSuperMix for Probes，上、下游引物各1.5 μL（終濃度750 nmol/L），探針0.5 μL（終濃度250 nmol/L），DNA模板（100～60 ng/μL）2 μL。將20 μL反應(yīng)預(yù)混液和70 μL微滴生成油分裝至微滴生成卡的對應(yīng)孔位中，置于微滴生成儀中進(jìn)行微滴生成。將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入96 孔反應(yīng)板，于QX200微滴式數(shù)字PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火及延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)；98 ℃固化微滴10 min；4 ℃反應(yīng)結(jié)束。將擴(kuò)增后的96 孔板置于微滴讀取儀中，利用QuantaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。以陰性微滴簇?zé)晒夥鹊淖罡唿c(diǎn)為界設(shè)定閾值線。

1.3.6 平板計(jì)數(shù)

對10 倍梯度稀釋的創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）純菌液，分別吸取1 mL于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。及時(shí)將15～20 mL冷卻至46 ℃的T1N1瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，36 ℃倒置培養(yǎng)（24±2）h。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，每個(gè)稀釋度菌落數(shù)應(yīng)取2 個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的平均數(shù)。

1.3.7 人工污染樣品的檢測

選擇經(jīng)傳統(tǒng)方法[6]驗(yàn)證無創(chuàng)傷弧菌的牡蠣樣品作為添加基質(zhì)。同時(shí)取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）菌液各25 mL分別添加到盛有25 g牡蠣樣品的均質(zhì)袋中，另取1 份25 g牡蠣樣品加入含3%氯化鈉的APW代替添加菌液作為陰性對照，上述樣品用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制成系列1∶1含有不同濃度創(chuàng)傷弧菌的污染樣品。取各樣品均質(zhì)液2 mL分別利用試劑盒法提取細(xì)菌基因組DNA，最終將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中，進(jìn)行ddPCR和real-time PCR檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

人工污染樣本的ddPCR和real-time PCR檢測均設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，通過t檢驗(yàn)比較2 種方法的定值結(jié)果，P＜0.05，差異顯著。同時(shí)將ddPCR和real-time PCR測定結(jié)果分別與人工污染樣本的理論添加值進(jìn)行一元線性回歸分析，以ddPCR或real-time PCR測定結(jié)果作為縱坐標(biāo)，各稀釋度理論添加值為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸直線，比較ddPCR和real-time PCR的定值準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的設(shè)計(jì)與篩選

圖1 real-time PCR（A、B）和ddPCR（C、D）對引物探針的篩選和特異性驗(yàn)證Fig. 1 Screening and specificity verification of primers/probes used for real-time PCR (A and B) and ddPCR (C and D)

分別以創(chuàng)傷弧菌單拷貝基因nplD、rpoS、vcgE和met為靶基因設(shè)計(jì)出4 對引物、探針，同時(shí)采用real-time PCR和ddPCR對創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）基因組DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 組引物探針在real-time PCR和ddPCR的檢測體系中均能進(jìn)行有效擴(kuò)增，且met-F/R/P的熒光信號強(qiáng)度最大，擴(kuò)增效果最好（圖1A、C）。進(jìn)而利用met-F/R/P引物探針對表1所列菌株DNA進(jìn)行real-time PCR和ddPCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)real-time PCR僅對創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 27562）和20 株自分離株出現(xiàn)陽性擴(kuò)增信號，其他食源性致病菌均呈陰性（圖1B）；ddPCR對創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）檢測呈陽性，對副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌與河流弧菌met基因檢測均呈陰性（圖1D）。綜上可見，met-F/R/P靈敏、特異，且同時(shí)滿足real-time PCR和ddPCR的擴(kuò)增條件，將其用于后續(xù)的定量分析實(shí)驗(yàn)。

2.2 創(chuàng)傷弧菌純菌液中ddPCR與real-time PCR、平板計(jì)數(shù)、超微量分光光度計(jì)測定結(jié)果的比較

圖2 梯度稀釋的創(chuàng)傷弧菌純菌液ddPCR擴(kuò)增微滴分布圖（A）與real-time PCR擴(kuò)增圖譜（B）Fig. 2 Ampli fication curves of gradient dilutions of V. vulni ficus by ddPCR (A) and real-time PCR (B)

創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）的過夜培養(yǎng)菌懸液經(jīng)平板計(jì)數(shù)測得其濃度為1.3×109CFU/mL，其對數(shù)值為9.11。經(jīng)超微量分光光度計(jì)測定，其原始菌液DNA質(zhì)量濃度為413.6 ng/μL，代入1.3.3節(jié)公式算得基因組DNA濃度為7.6×107拷貝數(shù)/μL，按照1 拷貝基因組對應(yīng)1 個(gè)CFU菌落，則原始菌液濃度為3.8×109CFU/mL，其對數(shù)值為9.57。取各稀釋度菌液DNA同時(shí)進(jìn)行ddPCR和real-time PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ddPCR可檢測到10-8稀釋度（圖2A），而real-time PCR僅檢測到10-7（圖2B）。ddPCR在10-2稀釋度達(dá)到檢測上限，陽性微滴的比率達(dá)100%，ddPCR的定值動(dòng)態(tài)范圍為10-3～10-7稀釋度（圖2A，表3），由不同稀釋度菌液計(jì)算出原菌液中創(chuàng)傷弧菌met基因含量的對數(shù)平均值為9.46，同核酸蛋白分析儀及平板計(jì)數(shù)法測得值均非常接近，分別相差了0.11、0.35 個(gè)對數(shù)值（圖3）。

表3 梯度稀釋的創(chuàng)傷弧菌純菌液ddPCR定量檢測結(jié)果Table 3 Quantitative results of ddPCR for gradient dilutions of V. vulnificus

圖3 創(chuàng)傷弧菌純菌液中基因組濃度定值結(jié)果比較Fig. 3 Comparison of results of determination of genomic concentration in pure culture of V. vulnificus

2.3 人工污染樣品中ddPCR與real-time PCR定量檢測結(jié)果的比較

圖4 人工污染牡蠣樣品real-time PCR擴(kuò)增曲線圖（A）與ddPCR擴(kuò)增微滴分布圖（B）Fig. 4 Real-time PCR amplification curves (A) and ddPCR amplification droplet distribution (B) of artificially contaminated oyster samples

表4 ddPCR與real-time PCR對人工污染牡蠣樣品中創(chuàng)傷弧菌的定量檢測結(jié)果Table 4 Quantitative results of V. vulni ficus in arti ficially contaminated oyster samples by ddPCR and real-time PCR

取10-7～10-4稀釋度創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562純菌液添加到牡蠣樣品中制成人工污染陽性樣本。根據(jù)添加菌液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果，預(yù)計(jì)污染樣品中創(chuàng)傷弧菌含量為9.2×101～9.2×104CFU/g。real-time PCR檢測擴(kuò)增曲線如圖4A所示，根據(jù)Ct值和得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算污染樣品中創(chuàng)傷弧菌平均含量分別為415 400、29 102、1 954、165 拷貝數(shù)/g（表4）。而ddPCR檢測結(jié)果顯示，隨著污染水平的下降，陽性微滴數(shù)量逐漸減少（圖4B），由QuantaSoft軟件計(jì)算測定的創(chuàng)傷弧菌含量分別為133 200、11 610、1 210、113 拷貝數(shù)/g（表4）。經(jīng)過t檢驗(yàn)，real-time PCR和ddPCR的定量結(jié)果在10-7菌液污染樣本中無顯著性差異（P＞0.05），而其余3 個(gè)高水平（10-6、10-5、10-4稀釋度）污染樣本中2 種方法定值結(jié)果存在顯著性差異（P＜0.05）。經(jīng)線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)ddPCR的定量結(jié)果更接近預(yù)計(jì)值，約為平板計(jì)數(shù)結(jié)果的1.4 倍，而real-time PCR定量結(jié)果則為平板計(jì)數(shù)的4.5 倍（圖5），說明ddPCR的準(zhǔn)確度優(yōu)于real-time PCR。

圖5 real-time PCR（A）和ddPCR（B）對人工污染牡蠣樣品中創(chuàng)傷弧菌含量的測定結(jié)果同平板計(jì)數(shù)預(yù)計(jì)值間的相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation analysis between experimental values from real-time PCR (A) and ddPCR (B) and predicted values from plate counting for V. vulnificus in artificially contaminated oyster samples

2.4 ddPCR的檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）

在檢測動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，測得內(nèi)外源基因拷貝數(shù)的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）不高于25%的最低濃度水平，即為LOQ；能被可靠檢測到，而不一定定值的最低拷貝數(shù)，即為LOD。ddPCR對創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）10-7和10-8稀釋度菌液DNA的檢測CV分別為17.01%和79.13%，因此LOD和LOQ分別為61 拷貝數(shù)/mL和323 拷貝數(shù)/mL（表3）。在人工污染牡蠣樣品中，ddPCR在不經(jīng)增菌培養(yǎng)的條件下能最低能檢測到1.13×102拷貝數(shù)/g的創(chuàng)傷弧菌（CV為17.02%）。

2.5 ddPCR檢測重復(fù)性分析

針對創(chuàng)傷弧菌純菌液（表3）和人工污染牡蠣樣品的檢測結(jié)果（表4）顯示，在整個(gè)定量檢測動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)ddPCR測定結(jié)果CV普遍小于20%，滿足國際上對核酸定量方法的驗(yàn)證要求，而且在對人工污染牡蠣樣品的檢測中，ddPCR定量結(jié)果的CV普遍小于real-time PCR，說明ddPCR具有更好的重復(fù)性。

3 結(jié)論與討論

本研究建立的水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的ddPCR精準(zhǔn)定量檢測技術(shù)，無需進(jìn)行增菌培養(yǎng)及后續(xù)的特征性菌落鑒定、生化分析等步驟，大幅縮短檢測時(shí)間，簡化操作流程，展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

首先，選取創(chuàng)傷弧菌4 個(gè)單拷貝基因分別設(shè)計(jì)1 組引物和探針，發(fā)現(xiàn)met-F/R/P無論是在real-time PCR還是ddPCR中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光擴(kuò)增信號，且與其他常見弧菌和食源性致病菌均無非特異性反應(yīng)，呈現(xiàn)出良好的包容性和排他性。利用該ddPCR技術(shù)對創(chuàng)傷弧菌純菌液的LOD和LOQ分別為61 拷貝數(shù)/mL和323 拷貝數(shù)/mL（表3）；對人工污染牡蠣樣品，在不經(jīng)增菌培養(yǎng)的條件下ddPCR的LOQ可達(dá)113 拷貝數(shù)/g，滿足國際微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)以及GB 29921—2013《食品中致病菌限量》對水產(chǎn)品中弧菌的最高安全限量要求（1 000 CFU/g）[24]。

在梯度稀釋的創(chuàng)傷弧菌純菌液中，ddPCR和real-time PCR的檢測范圍分別達(dá)10-3～10-8及10-2～10-7，可見ddPCR對創(chuàng)傷弧菌的檢測靈敏度高于real-time PCR，但在當(dāng)菌液濃度高至一定程度（10-2稀釋度），ddPCR的陽性擴(kuò)增微滴達(dá)到100%時(shí)，即超出了ddPCR的定值范圍。因此，ddPCR更適于低濃度樣品的檢測，而real-time PCR則不受限于靶基因的高濃度，這與已有研究結(jié)論一致[25]。鑒于水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的感染量往往較低，因此并不影響ddPCR技術(shù)在水產(chǎn)品中的應(yīng)用。在人工感染的牡蠣樣品中，ddPCR的定量結(jié)果更接近理論添加值，相關(guān)性分析顯示ddPCR檢測結(jié)果為平板計(jì)數(shù)結(jié)果的1.4 倍，而real-time PCR則為平板計(jì)數(shù)的4.5 倍（圖5）。究其原因，一方面real-time PCR作為一種相對定量檢測技術(shù)，其結(jié)果很大程度上依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，在本研究中，標(biāo)準(zhǔn)樣品是提取自創(chuàng)傷弧菌純菌液的基因組DNA，與提取自牡蠣樣品的待測核酸必然存在擴(kuò)增效率差異，且標(biāo)準(zhǔn)品DNA的梯度稀釋、紫外分光光度法對DNA濃度的測定，都會(huì)導(dǎo)致檢測誤差的產(chǎn)生。而ddPCR是直接對提取自牡蠣樣品中的DNA進(jìn)行定量分析，且是終點(diǎn)檢測，對樣品中抑制劑的耐受度更高[26-29]，因此呈現(xiàn)出更高的定量準(zhǔn)確性和良好的檢測重復(fù)性（測定結(jié)果CV普遍小于20%），特別是在低污染樣品中這種優(yōu)勢更加明顯。

本研究建立的ddPCR檢測方法能快速準(zhǔn)確、特異、靈敏地定量檢測創(chuàng)傷弧菌，特定樣品中細(xì)菌真實(shí)數(shù)量的定量檢測在風(fēng)險(xiǎn)評估中的作用至關(guān)重要[30]，對突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測、控制疫情擴(kuò)散、提高病原菌檢出率等均有重要意義。