池塘沉積物對上覆水脫氮作用的初步探究

付賢茂，羅國芝,2,3，劉文暢，譚洪新,2,3

(1 上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點試驗室，上海 201306；3上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級試驗教學(xué)示范中心，上海 201306)

氮循環(huán)是水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的一個重要組成部分。養(yǎng)殖活動中，飼料等輸入的氮量占整個養(yǎng)殖系統(tǒng)總氮輸入量的90%[1]。但其中只有不到25%的氮被養(yǎng)殖對象轉(zhuǎn)化到體內(nèi)，大約有30%總氮(TN)以殘飼、糞便形式進(jìn)入池塘水體或沉積物中[2]。沉積物作為養(yǎng)殖池塘氮和其他元素的集中地，脫氮生物群落在其中扮演著重要角色[3]。沉積物不但能夠吸附水體中的氮、磷、硫等元素，調(diào)節(jié)水體水質(zhì)狀況，而且是益生菌以及底棲生物生長繁殖的場所。但是沉積物積累會逐漸敗壞水質(zhì)、釋放硫化氫等有毒物質(zhì)[4-5]。一般采用曬塘和挖掘方法去除沉積物和污染物，但是這種方式無法避免更深層的氮素再礦化，挖掘出來的沉積物也會對環(huán)境造成污染[6]。因此，基于生物脫氮的原位修復(fù)方法可能更安全和更經(jīng)濟(jì)[7]。

以堿度為調(diào)控因子，研究池塘沉積物上覆水的脫氮效果和微生物群落，初步分析其脫氮規(guī)律以及微生物特性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

1.2 試驗沉積物反應(yīng)器設(shè)置

采用12個室內(nèi)玻璃纖維反應(yīng)器(直徑30 cm，高50 cm，工作體積15 L)開展試驗，設(shè)置A組(對照組)、B組、C組、D組，每組3個重復(fù)。每個容器接種10 cm攪拌均勻的沉積物樣品。試驗廢水采用人工配水[13]，并通入N2使溶氧達(dá)到1.5～2.0 mg/L。為避免攪動沉積物，使用虹吸法向每個反應(yīng)器加入2 L人工配水。反應(yīng)器用錫箔紙密封避光，試驗用小蘇打(NaHCO3)調(diào)控堿度，各組投加量：A組0 mg/L，B組300 mg/L，C組500 mg/L，D組700 mg/L；初始堿度(以CaCO3計)分別為(143.3±7.10)mg/L、(275.2±22.01)mg/L、(385.1±28.01)mg/L和(466.5±61.50)mg/L。

1.3 檢測方法

R=(C1-C2)/C1×100%

(1)

總DNA提取及PCR擴(kuò)增：使用DNA提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用 Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測。以 20～30 ng DNA為模板，使用PCR引物擴(kuò)增原核生物16SrDNA上包括V3及V4的2個高度可變區(qū)。上游引物序列為(CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT)，下游引物為(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC),PCR擴(kuò)增體系(25 μL)TransStart Buffer2.5 μL，dNTPs.2 μL，primers.1 μL × 2，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板DNA 20 ng，ddH2O補(bǔ)至總體積25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性參數(shù)94 ℃ 3 min × 1，變性參數(shù)94°C 5 sec，退火參數(shù) 57 ℃ 90 sec，延伸72 ℃ 10 s，終延伸參數(shù)72 ℃ 5 min，共進(jìn)行24個循環(huán)。

高通量測序：采用Illumina MiSeq測序系統(tǒng)對采集的底泥樣品進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 上覆水脫氮作用的影響

表1 試驗期間沉積物水處理效果

圖1 試驗期間總氮(a)、氨氮(b)、亞硝酸鹽氮(c)及硝酸鹽氮(d)的動態(tài)變化

試驗期間堿度變化如圖2所示。A組試驗過程中堿度維持穩(wěn)定，但是B、C和D組堿度均呈下降趨勢，最終分別降至(160.66±17.70)mg/L、(191.53±25.09)mg/L和(226.89±20.23)mg/L。

圖2 試驗期間各組堿度動態(tài)變化

2.2 沉積物微生物群落動態(tài)分析

高通量測序鑒定出門水平微生物群落相對豐度如圖3所示。

圖3 初始沉積物組與試驗組優(yōu)勢菌群在門水平上的分布

初始沉積物與試驗組系統(tǒng)中主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和Epsilonbacteraeota。其中，變形菌門(68.1%±2.95%)豐度相對較高，占主導(dǎo)地位。而經(jīng)試驗馴化綠彎菌門與酸桿菌門相對豐度降低，分別從初始相對豐度9.48%，5.27%降低至5.7%，2.58%。硝化螺旋菌門隨著試驗時間的增加，其相對豐度也隨之增加。但試驗組與對照組微生物群落之間無明顯差異(P>0.05)，而與初始沉積物有顯著性差異(P<0.05)，這可能是因為試驗環(huán)境與池塘環(huán)境略有不同導(dǎo)致。

圖4所示為沉積物屬水平微生物相對豐度，其中硫桿菌(Thiobacillus)、(f__Steroidobacteraceae_Unclassified)和硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)為主要優(yōu)勢菌屬。未鑒別菌屬(Unclassified)相對豐度比例為10.77%～11.07%。其中硫桿菌(Thiobacillus)和Sulfurimonas是一類常見的自養(yǎng)型脫氮硫桿菌，主要與硫自養(yǎng)反硝化有關(guān)。值得注意的是，在試驗組中發(fā)現(xiàn)了硫堿螺旋桿菌屬(Thioalkalispira)(5.6%)，其相對豐度比初始沉積物(0.4%)較高。f__Steroidobacteraceae_Unclassified(12.6%)在初始沉積物中占主要優(yōu)勢菌種，但試驗組在馴化其相對豐度顯著下降至4.3%。

圖4 初始沉積物組與試驗組優(yōu)勢菌群在屬水平上的分布

3 討論

3.1 沉積物上覆水脫氮作用的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，不同堿度水平下，沉積物上覆水的水質(zhì)無顯著差異。水體中的TN去除效果明顯，說明沉積物對養(yǎng)殖水體中氮元素有一定的去除效果，與研究利用褐煤作為碳源對池塘沉積物中厭氧氨氧化與反硝化作用無添加碳源組的結(jié)果相似[15]，表明沉積物具有脫氮效果。

3.2 微生物群落分析

4 結(jié)論

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