徐海霞,李心紅
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院放療科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010060)
肝細胞癌(hepatocellular cancer,HCC) 是目前全球第二大癌癥死亡原因。在肝細胞癌患者中,約50%與肝炎有關肝細胞癌(HCC) 目前是全球第二大癌癥死亡原因[1-2]。MiRNA 為19-24nt 短核苷酸序列,可與多個靶序列互補結合。單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 是遺傳多態(tài)性的常見變異,被認為是預測癌癥風險的潛在生物標志物[3-5]。如果miRNA基因發(fā)生變異,可能會影響成熟miRNA 的質量和數(shù)量,甚至影響到被改變的miRNA 調(diào)控的數(shù)百個靶基因。因此,miRNA 單核苷酸多態(tài)性由pri-miRNA 單核苷酸多態(tài)性和pre-miRNA 單核苷酸多態(tài)性組成,分別位于miRNA 基因500~3 000 bp 和60~70 bp 區(qū)域[6]。
到目前為止,已有報道認為miRNA 單核苷酸與胃癌、食管癌、乳腺癌和神經(jīng)母細胞瘤等多種腫瘤相關[7]。本研究對蒙古族人肝細胞癌發(fā)展中的miR-196a2 rs2910164,miR-149 rs2292832 的多態(tài)性進行了分析,以期望能夠對于肝細胞癌的預防及診斷提供可靠的參考依據(jù)。
主要試劑:血液DNA 提取試劑盒購自天根生物公司。PCR 試劑盒購自全式金生物公司。
蒙古族肝癌患者均來自于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學屬醫(yī)院2018年10月至2019年12月。各個盟市來內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院的蒙古族80例肝細胞癌患者和蒙古族60例對照受試者是在我醫(yī)院進行體檢后隨機選擇。每一名受試者均簽署書面知情同意書。所有工作均在護士的幫助下完成。
1.3.1 血液DNA 的提取DNA 的提取按試劑盒說明書操作。簡單來說就是,取200 μL 的血液,加入200 μL的緩沖液肯20 μL的蛋白酶K,56℃消化10 min,期間混勻數(shù)次,直至溶液變清亮。室溫靜置3 min 然后加入350 μL的BD 緩沖液,混勻,倒入吸附柱CG2 中,13 400 g 離心30s,倒掉收集管中的液體。再加入500 μL的緩沖液GDB,13 400 g離心30 s 倒掉收集管中的液體。加入600 μL的漂洗液,13 400 g 離心30 s 倒掉收集管中的液體,重復此步驟,然后加入100 μL的洗脫液,13 400 g 離心2 min,收集液體保存。
1.2.2 基因檢測引物序列(表1):所有引物由上海生工程合成。
表2 酶切位點Tab.2 Restriction sites
然后進行PCR 反應。PCR 反應過程為,95℃5 min,(95 ℃30 s,56 ℃30 s,72℃30 s) 35個循環(huán),72 ℃40 min,4℃保存。
1.2.3 基因分析根據(jù)不同酶切位點進行酶切分析,所有酶切均在37℃下進行。酶切后進行電泳。
所有統(tǒng)計分析均由SPSS 軟件完成。絕對變量表示為頻率和百分比。分別通過雙尾studentt檢驗和χ2檢驗對連續(xù)變量與絕對變量間的不同進行分析。顯著水平為P<0.05。
SNP 位點均采用PCR 產(chǎn)物酶切,依據(jù)電泳圖可得到(圖1) miR-196a2 rs11614913,CC 為202 bp,CT 為202 bp+50 bp,TT 為50 bp。miR-149 rs2292832,CC 為135bp,CT 為135 bp+40 bp,TT為40 bp。
本研究的肝細胞癌患者和對照受試者登記錄入。肝細胞癌和對照受試者年齡、性別吻合度的P值(0.66 和1.00) 均大于0.05。
對 照 組 miR-196a2 rs11614913,miR-149 rs2292832 的基因型分布符合哈迪-溫伯格平衡定律,人口的抽樣合格。miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因與CC 基因型相比,肝細胞癌危險性分別增加了2.26 倍和1.50 倍,見表3。
miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性和肝細胞癌危險性之間的關系沒有受到年齡、性別,飲酒與否,居住地區(qū),腫瘤大小等影響,見表4。
圖1 miR-196a 和miR-149SNP 酶切電泳圖Fig.1 miR-196a and miR-149SNP digestion electrophoresis
表3 miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 多態(tài)性與肝細胞癌危險性之間的關系Fig.3 The relationship between miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 polymorphism and the risk of hepatocellular carcinoma
表4 人口統(tǒng)計及臨床特征Tab.4 Demographics and clinical characteristics
肝癌是世界上第二常見的惡性腫瘤,據(jù)估計每年有782 500例新發(fā)病例和745 500例死亡病例報告,其中50%以上來自中國[2,8]。miRNA 在真核生物中保存良好,被認為是基因調(diào)控的重要組成部分[9-11]。新的研究表明miRNA 參與了多種生物學過程,包括發(fā)育、分化、細胞生長和凋亡[10,12]。本研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌危險性增加與miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因有明顯的相關性[7,13]。有報道稱,肝癌患者中miR-196a2(rs11614913) 基因型的頻率有顯著差異[6]。據(jù)報道,miR-196a2 基因型分布與正常對照組相比有顯著性差異(C >T);發(fā)現(xiàn)miR-196a2cc 基因型和C等位基因在中國人肝癌發(fā)病中有重要作用,尤其是在 HBV 感染患者中研究表明 miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性可以作為肝細胞癌的診斷標記[8,14-16]。有 較 多 研 究 發(fā) 現(xiàn)miR-196a2 rs11614913的多態(tài)性與幾種癌癥,如胃癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌和腎癌的危險性顯著相關,但是結果不太一致[3]。miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性與胃癌危險性不相關。有研究發(fā)現(xiàn),miR-196a2 rs11614913 影響肺癌的易感性[6]。在印度人中做了研究,多元統(tǒng)計分析顯示miR-196a2 rs11614913 的多態(tài)性使絕經(jīng)后的婦女乳腺癌危險性增加了3.2 倍[4]。本研究為臨床診斷蒙古族肝癌的診斷奠定基礎。