厚軸茶雄性不育株花藥敗育的生物學(xué)特性和細(xì)胞學(xué)研究

蔣會(huì)兵 楊盛美 劉玉飛 田易萍 孫云南 陳林波 唐一春

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南勐海 666201

野生茶樹為山茶屬茶組(SectionThea)植物,是栽培茶樹的野生近緣種, 可制作茶葉直接飲用,或用于茶樹雜交育種。野生茶樹具有獨(dú)特的適應(yīng)性[1]和遺傳基因多樣性[2-3], 利用其蘊(yùn)涵的豐富基因資源創(chuàng)造育種新材料、研制茶葉新產(chǎn)品將成為國(guó)內(nèi)外茶學(xué)科技發(fā)展的新領(lǐng)域。2014年, 課題組從國(guó)家種質(zhì)勐海茶樹分圃保存的野生茶樹厚軸茶(Camellia crassocolumnaH. T. Chang)群體中首次發(fā)現(xiàn)天然雄性不育種質(zhì), 這為開展茶樹不育性育種和雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了重要的材料基礎(chǔ), 同時(shí)對(duì)深入研究茶樹的繁衍進(jìn)化和遺傳變異等理論問題具有重要意義。

植物雄性不育的研究一直是植物雜種優(yōu)勢(shì)利用和生殖發(fā)育研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。國(guó)內(nèi)外研究者從植物雄性不育的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究工作,取得了一系列新進(jìn)展。我國(guó)已在水稻、擬南芥等多種作物上開展了雄性不育基因定位及功能分析研究,克隆了一些與雄性不育有關(guān)基因, 闡明了這些基因在減數(shù)分裂[4]、絨氈層形成[5]、小孢子營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[6]和花粉外壁發(fā)育[7]等方面的作用, 提高了人們對(duì)雄性不育機(jī)理的認(rèn)識(shí)。不同的植物雄性不育材料, 其敗育的時(shí)期、方式和原因不盡相同。植物花藥敗育的細(xì)胞生物學(xué)研究是聯(lián)系分子水平與個(gè)體水平研究的中間環(huán)節(jié), 是全面了解雄性不育花藥和花粉敗育的基礎(chǔ)[8]。目前已在禾本科[9]、茄科[10]和十字花科[11]等多種作物上開展了花藥結(jié)構(gòu)與功能的細(xì)胞學(xué)研究,闡明了這些植物雄性不育發(fā)生敗育的時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特征, 探索了植物雄性不育花藥的敗育過程。

茶樹生殖發(fā)育體系的研究已從外部形態(tài)發(fā)展到分子水平, 茶樹花發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)研究也取得了進(jìn)展[12-13]。然而, 有關(guān)茶樹花發(fā)育的細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究仍較缺乏, 江昌俊等[14]和施雁飛等[15]分別對(duì)茶樹胚胎和花芽的形成與發(fā)育過程進(jìn)行了解剖觀察, 但都未涉及到雄性不育現(xiàn)象。茶樹雄性不育機(jī)制的基礎(chǔ)研究, 國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)還未見報(bào)道。本研究從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方面比較觀察不同遺傳背景下的厚軸茶雄性不育株花器發(fā)育進(jìn)程和不育類型, 擬闡明厚軸茶雄性不育株花藥和花粉發(fā)生敗育的時(shí)期及其細(xì)胞學(xué)特點(diǎn), 完善茶樹生殖生物學(xué)研究, 為深入研究茶樹雄性不育機(jī)理和雜種優(yōu)勢(shì)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以國(guó)家種質(zhì)勐海茶樹分圃保存的厚軸茶(C.crassocolumna)雄性不育株(圃編號(hào)為M350)和可育株(圃編號(hào)為M352)為試驗(yàn)材料。該厚軸茶種群為1984年征集入圃, 有性繁殖, 種植行距1.5 m、株距0.33 m, 樹齡30 余年, 常規(guī)管理, 觀測(cè)期間不修剪。試驗(yàn)地位于100°25'E, 21°55'N, 海拔高度1150 m,屬亞熱帶西南季風(fēng)氣候。年平均溫度18.1℃, 活動(dòng)積溫6600℃,年平均降水量1400 mm,年平均相對(duì)濕度82%。

1.2 取材與固定

2018年, 從厚軸茶現(xiàn)蕾至花朵盛開, 上午9：00-10：00 時(shí), 隨機(jī)采集雄性不育株和可育株不同發(fā)育時(shí)期花蕾。根據(jù)花蕾形態(tài)特征, 以花蕾橫徑長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn), 結(jié)合花藥壓片鏡檢法確定不同發(fā)育時(shí)期,將其分為以下6 級(jí)。

(1) 1 級(jí)花蕾(橫徑≥7.00 mm), 花粉母細(xì)胞及之前時(shí)期;

(2) 2 級(jí)花蕾(橫徑7.10～7.90 mm), 減數(shù)分裂期為主;

(3) 3 級(jí)花蕾(橫徑8.00～8.50 mm), 四分體時(shí)期為主;

(4) 4 級(jí)花蕾(橫徑8.60～9.50 mm), 單核花粉期為主;

(5) 5 級(jí)花蕾(橫徑9.60～10.50 mm), 二核花粉期為主;

(6) 6級(jí)花蕾(橫徑≥11.00 mm), 完全成熟花粉期。

將各級(jí)花蕾分別用卡諾氏固定液(95%乙醇∶冰醋酸=3∶1)室溫固定24 h, 梯度乙醇(95%、85%、70%)清洗, 轉(zhuǎn)入70%乙醇中, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 花部形態(tài)特征觀察

田間觀察厚軸茶雄性不育株和正?？捎甑幕ㄆ餍螒B(tài)及發(fā)育情況。隨機(jī)采集不育株和可育株上部、中部和下部的花蕾和開放花朵, 用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾橫徑, 直尺測(cè)量花冠大小、花瓣長(zhǎng)、花瓣寬、花絲長(zhǎng)度和花柱長(zhǎng)度。用體視顯微鏡(LEICA M165C/DMC4500)觀察花藥、花絲和花柱形態(tài)并拍照。觀察每級(jí)10 個(gè)花蕾, 重復(fù)3 次。

1.4 花藥石蠟切片觀察

采用常規(guī)石蠟切片程序制片[16]。取固定好的花蕾, 經(jīng)逐級(jí)乙醇(70%、85%、95%、100%)脫水, 二甲苯透明, 石蠟浸蠟和包埋, SLEE CUT5062 切片機(jī)橫切, 切片厚度8 μm, 郝伯特配方粘片劑粘片, 38℃恒溫箱烤片, 番紅-固綠染色液染片, 梯度乙醇再次退水、二甲苯透明, 中性樹膠封片。用 LEICA DM4000 熒光顯微鏡觀察并照相。觀察每級(jí)10 個(gè)花蕾, 重復(fù)3 次。

1.5 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

采用改良苯酚品紅壓片法制片[17]。取固定好的花蕾, 經(jīng)蒸餾水漂洗2～3 次, 轉(zhuǎn)入1 mol L-1HCl 溶液, 60℃水解10 min, 蒸餾水洗凈。挑出2～3 枚花藥置載玻片上, 加1 滴改良苯酚品紅染液, 用鑷子挑破花藥并搗碎, 染色2～3 min, 蓋上蓋玻片、濾紙,均勻壓片。用LEICA DM4000 熒光顯微鏡觀察并照相。觀察每級(jí)10 個(gè)花蕾, 重復(fù)3 次。

1.6 小孢子發(fā)育過程熒光顯微觀察

采用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)熒光染色法[18], 觀察小孢子發(fā)育過程。取固定好的花藥(四分體至成熟花粉期), 轉(zhuǎn)入1 mol L-1HCl 溶液, 60℃水解15 min, 用PBS 緩沖液洗滌3 次(10 min 次-1), 并保存于PBS 緩沖液中。挑出2～3 枚花藥置載玻片上, 搗碎, 加1 滴2 μg mL-1DAPI 染色液, 迅速蓋片, 適度輕壓, 黑暗中染色8～10 min。用LEICA DM4000 熒光顯微鏡觀察并拍照。觀察每級(jí)10 個(gè)花蕾, 重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚軸茶花器外部形態(tài)特征

厚軸茶每朵花均由花梗、花托、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊6 部分組成, 屬完全花(圖1-A)?；ü］^粗, 通常下彎, 花梗頂端為碟狀圓平花托, 著生雄蕊群?；ㄝ? 片、綠色、外側(cè)被茸毛、宿存, 花瓣9～12 枚、白色。雄蕊由花絲和花藥組成, 為多體雄蕊, 分內(nèi)外2 輪, 外輪花絲較長(zhǎng), 花絲基部與花瓣連生。雌蕊1 枚, 由子房、花柱和柱頭3 部分組成, 柱頭3～4 裂、外翻、被茸毛。子房上位、3～4 室、密被茸毛, 具花盤蜜腺。雄性不育株的花器官組成與可育花相同, 但表現(xiàn)出明顯的雄性不育特征： 花絲彎曲, 花藥合生, 相互黏連, 聚合成一團(tuán)錐體, 環(huán)繞花柱, 類似于菊科植物中的“聚藥雄蕊”, 且花藥干癟、變形、呈壞死色澤, 不裂藥, 無花粉散出, 但花冠正常展開, 花瓣完整, 雌蕊發(fā)育良好, 花柱長(zhǎng)柱型, 柱頭外露, 能異交結(jié)實(shí)(圖1-B)。

圖1 可育株M352 和雄性不育株M350 的花器官形態(tài)Fig. 1 Flower morphology of fertile plant M352 and male sterile plant M350

表1 表明, 可育花和雄性不育花在花冠大小、花瓣大小、花柱長(zhǎng)度和雄蕊數(shù)量等指標(biāo)上的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 僅花絲長(zhǎng)度差異顯著(P＜0.05)?？捎ê筒挥ǖ幕ü谥睆椒謩e為7.28 cm和6.94 cm, 花瓣長(zhǎng)分別為3.53 cm 和3.20 cm, 花瓣寬分別為2.80 cm 和3.07 cm, 外輪花絲長(zhǎng)分別為1.66 cm 和1.37 cm, 內(nèi)輪花絲長(zhǎng)分別為0.94 cm 和0.65 cm, 花柱長(zhǎng)分別為1.61 cm 和1.73 cm, 雄蕊數(shù)量分別為190.62 個(gè)和184.85 個(gè)。

不育株與可育株的花蕾發(fā)育進(jìn)程基本一致?；ɡ贆M徑約≤7. 00 mm 時(shí), 花藥白色透明, 為花粉母細(xì)胞及之前時(shí)期(圖2-A)?；ɡ贆M徑約7.10～7.90 mm時(shí), 花藥米黃色, 為減數(shù)分裂期(圖2-B)?；ɡ贆M徑約8.60～9.50 mm 時(shí), 花藥淡黃色, 為單核花粉期(圖2-C)?；ɡ贆M徑約9.60～10.50 mm 時(shí), 花藥鮮黃色,為二核花粉期(圖2-D)。花蕾橫徑約≥11.00 mm 時(shí),花藥橘黃色, 為成熟花粉期(圖2-E)。這表明花蕾大小及花藥色澤與花蕾發(fā)育進(jìn)程有密切的相關(guān)性, 可作為判斷花蕾所處發(fā)育時(shí)期的外部形態(tài)指標(biāo), 為取樣提供確切依據(jù)。

在花蕾發(fā)育過程中, 可育株花藥飽滿, 色澤鮮艷, 展花后, 花絲伸直, 花藥彼此分離, 有大量花粉散出(圖2-E)。不育株花蕾發(fā)育早期(減數(shù)分裂及之前時(shí)期), 其雄蕊發(fā)育正常, 花絲、花藥形狀規(guī)則, 與可育株無明顯差異(圖2-F, G)。但在花蕾發(fā)育后期(單核期以后), 不育株的花藥排列緊密, 無間隙(圖2-H,I)。展花后, 花絲彎曲, 無法伸直, 花藥彼此粘連,呈褐色、灰白色, 與可育株存在明顯差異(圖2-J)。從花器官表型來看, 該厚軸茶雄性不育花器官形態(tài)屬雄蕊萎縮型和花藥異常型。

2.2 厚軸茶花藥的發(fā)育過程

表1 可育株M352 和雄性不育株M350 開花期花器性狀比較Table 1 Comparison of flower traits between fertile plant M352 and male sterile plant M350

圖2 可育株M352 和雄性不育株M350 花蕾發(fā)育過程Fig. 2 Comparison of buds development between fertile plant M352 and male sterile plant M350

切片觀察顯示, 厚軸茶花藥發(fā)育主要經(jīng)歷了造孢細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、減數(shù)分裂、四分體、單核花粉、二核花粉和成熟花粉等7 個(gè)時(shí)期。造孢細(xì)胞期,藥室表皮、內(nèi)壁、中層、絨氈層和造孢細(xì)胞均已形成, 造胞細(xì)胞位于藥室內(nèi)側(cè)中央(圖3-A)。花粉母細(xì)胞期, 花粉母細(xì)胞被胼胝質(zhì)包繞, 細(xì)胞核大, 絨氈層排列整齊, 細(xì)胞質(zhì)濃厚(圖3-B)。減數(shù)分裂期, 花粉母細(xì)胞體積變大, 開始減數(shù)分裂, 絨氈層細(xì)胞充分發(fā)育, 具雙核(圖3-C)。四分體時(shí)期, 可見胼胝質(zhì)包裹的四面體型小孢子, 絨氈層收縮, 形成分泌型,開始退化(圖3-D)。單核期, 花粉外壁開始形成, 絨氈層液泡化, 降解加速(圖3-E)。雙核期, 單核花粉發(fā)育成二核花粉, 絨氈層充分降解, 藥室內(nèi)壁縱向增厚(圖3-F)。成熟花粉期, 花粉粒橢圓形、胞質(zhì)飽滿、染色深, 絨氈層完全解體, 藥室內(nèi)壁呈“U”型進(jìn)一步增厚, 兩花粉囊交界處細(xì)胞層變薄、破裂消失、縱行開裂, 完成散粉(圖3-G, H)。

圖3 可育株M352 花藥發(fā)育過程Fig. 3 Anther pollen development process of fertile plant M352

與正常可育花藥的發(fā)育相比較, 敗育花藥在造孢細(xì)胞和花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥壁各層發(fā)育良好, 與可育花無明顯差異(圖4-A, B)。但在減數(shù)分裂期, 敗育花藥絨氈層細(xì)胞異常加厚、增生, 排列混亂, 脫離藥室壁, 包圍、擠壓花粉母細(xì)胞, 花粉母細(xì)胞原生質(zhì)體異常收縮, 細(xì)胞壁、細(xì)胞膜解體消失, 細(xì)胞粘連和胞質(zhì)融合、核仁消失, 處于解體狀態(tài), 不能進(jìn)行減數(shù)分裂(圖4-C)。四分體時(shí)期, 敗育花藥絨氈層仍呈現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)濃厚, 細(xì)胞核大的特征, 未形成分泌型,四分體形狀不規(guī)則、或解體破碎(圖4-D)。單核花粉期, 敗育花藥絨氈層胞質(zhì)凝集, 異常凋亡, 花粉粒皺縮, 胞質(zhì)稀薄, 內(nèi)含物降解(圖4-E)。雙核花粉期,敗育花藥絨氈層液泡化, 延遲降解, 花粉粒形態(tài)異常, 細(xì)胞質(zhì)和核仁消失, 成為空癟花粉(圖4-F)。成熟花粉期, 敗育花藥藥室扭曲、不規(guī)則, 花粉囊內(nèi)含有空癟、畸形花粉粒(圖4-G)或殘留有解體的花粉母細(xì)胞殘留物(圖4-H)。從花藥結(jié)構(gòu)組織切片來看, 厚軸茶雄性不育株花藥在減數(shù)分裂至成熟花粉期均能觀察到異?，F(xiàn)象, 且同一花蕾及同一花藥內(nèi)敗育進(jìn)程并不完全一致, 但最終完全敗育。

2.3 厚軸茶花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

圖5 可育株M352 花粉母細(xì)胞正常減數(shù)分裂過程Fig. 5 Normal meiosis of pollen mother cells of fertile plant M352

花粉母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂I、減數(shù)分裂Ⅱ和胞質(zhì)分裂后形成四分體。間期I, 染色質(zhì)凝結(jié)成團(tuán), 位于細(xì)胞中央(圖5-A)。前期I細(xì)線期, 染色質(zhì)濃縮形成細(xì)長(zhǎng)如線的染色體, 細(xì)胞核增大(圖5-B)。前期I偶線期,同源染色體開始聯(lián)會(huì), 可見多處形成的聯(lián)接點(diǎn), 仍為細(xì)線狀(圖5-C)。前期I粗線期, 同源染色體完成配對(duì), 染色體相互纏繞, 明顯縮短變粗(圖5-D)。前期I雙線期, 染色體進(jìn)一步縮短、互相排斥、彼此分離、交叉存在(圖5-E)。前期I 終變期, 染色體螺旋化, 每對(duì)二價(jià)體均勻分散于細(xì)胞內(nèi), 可清晰地觀察到15 對(duì)二價(jià)體(圖5-F)。中期I, 核膜、核仁消失, 染色體整齊、集中排列在赤道板中央(圖5-G)。后期I, 染色體受紡錘體牽引, 向兩極移動(dòng), 染色體數(shù)目減半(圖5-H)。末期I, 染色體到達(dá)細(xì)胞兩級(jí), 逐漸形成細(xì)胞板(圖5-I)。前期II, 細(xì)胞兩極的染色體松散變細(xì),形成2 個(gè)子核(圖5-J)。中期II, 染色體平行排列在分裂細(xì)胞的赤道板上(圖5-K)。后期II, 姊妹染色單體分離, 由紡錘絲牽引移向兩極(圖5-L)。末期II, 到達(dá)兩極的染色體濃縮在 4 個(gè)極區(qū)成 4 個(gè)團(tuán)塊(圖5-M)。四分體時(shí)期, 此時(shí)進(jìn)行胞質(zhì)分裂, 各孢子形成胼胝質(zhì), 4 個(gè)小孢子又被共同的胼胝質(zhì)壁所包圍, 形成四分體(圖5-N)。在同一花蕾或同一花藥內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞分裂具同步性, 但在各個(gè)分裂時(shí)期均存在少數(shù)不同步分裂相, 最大跨度達(dá)4 個(gè)分裂相(圖5-O)。

敗育花藥花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中存在環(huán)狀單價(jià)體、染色體橋、滯后染色體, 不對(duì)稱、不均等分離, 染色體斷片、缺失, 微核、三分體、異常四分體、五核四分體、六核四分體等諸多異?，F(xiàn)象。前期I, 染色體異常聯(lián)會(huì), 非同源染色體發(fā)生易位, 形成環(huán)狀單價(jià)染色體(圖6-A～C)。在后期I 和后期II, 染色體向兩極移動(dòng)時(shí), 出現(xiàn)單橋、雙橋和多橋等染色體橋(圖6-D～G)。在中期I、后期I 和末期I 等時(shí)期, 存在染色體不同步移動(dòng), 成為落后染色體(圖6-H～K)。在前期I、后期I、末期I 和后期II 等時(shí)期, 一些細(xì)胞中染色體明顯減少、缺失, 染色體散亂排列或處于凝集狀態(tài)(圖6-L～P)。在中期II 和后期II, 染色體分裂不同步, 不對(duì)稱, 不等分(圖6-Q～S)。在減數(shù)分裂的前期I、前期II 等分裂時(shí)期均觀察到微核存在(圖6-T～V)。在四分體形成時(shí)期, 4 個(gè)子細(xì)胞大小不同,形態(tài)異常, 細(xì)胞質(zhì)解體, 同時(shí)還觀察到有三分體、多核四分體的存在(圖6-W～Y)。

對(duì)厚軸茶雄性不育株和可育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程及染色體行為統(tǒng)計(jì)分析表明(表2), 可育株絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程正常, 僅有不同步分裂相異常頻率較高?？捎昊ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體平均異常頻率為13.65%。雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的細(xì)線期、偶線期和粗線期未能觀察到染色體異常, 但從雙線期開始, 直到四分體時(shí)期, 均能觀察到各種異常現(xiàn)象。雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體平均異常頻率為38.40%, 其中后期I、前期II 和四分體時(shí)期異常頻率較高?？梢? 雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體異常頻率高于正?？捎? 說明雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體異常行為可能是導(dǎo)致其花藥和花粉敗育的原因之一。

2.4 厚軸茶小孢子發(fā)育過程觀察

對(duì)四分體至成熟花粉期花藥細(xì)胞的DAPI 染色顯示, 正?？捎昊ㄋ巸?nèi)的四分體形態(tài)規(guī)則, 著色深, 細(xì)胞核明亮(圖7-A)。小孢子呈三角形, 細(xì)胞質(zhì)濃稠, 細(xì)胞核大、位居中央, 為單核花粉早期(圖7-B)。隨著小孢子體積增大, 花粉粒外壁開始形成, 細(xì)胞壁呈收縮狀態(tài), 為單核居中期(圖7-C)。之后, 細(xì)胞膨大變圓, 花粉壁加厚, 可見花粉壁上3 個(gè)萌發(fā)溝,細(xì)胞核靠邊, 為單核靠邊期(圖7-D)。隨著花粉的發(fā)育, 細(xì)胞質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞, 出現(xiàn)一個(gè)圓形的營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)長(zhǎng)形的精核, 為二核花粉期(圖7-E)。

雄性不育株大部分花粉母細(xì)胞能經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體, 并發(fā)育至單核花粉期, 但表現(xiàn)不育特征,四分體和游離小孢子形狀不規(guī)則, 細(xì)胞核散亂模糊,染色淺, 出現(xiàn)擬四分孢子、擬小孢子現(xiàn)象(圖7-F, G)。單核花粉期花粉壁皺縮, 花粉粒相互黏連變形、花粉內(nèi)細(xì)胞質(zhì)稀薄、染色淺(圖7-H)。單核靠邊期花粉壁未能進(jìn)一步加厚, 花粉內(nèi)含物降解, 未見萌發(fā)孔或萌發(fā)孔皺縮閉合(圖7-I)。二核花粉期, 花粉內(nèi)含物消失, 細(xì)胞空胞化, 花粉壁進(jìn)一步皺縮、變形, 成為敗育花粉(圖7-J)。單核花粉期是該厚軸茶雄性不育株花藥和花粉敗育的主要時(shí)期。

3 討論

3.1 厚軸茶雄性不育株花藥敗育的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

植物雄性不育花器形態(tài)特征存在多種表型和育性程度的變異, 可將其大致分為花冠退化型、雄蕊萎縮型、花藥異常型、小孢子退化型和花粉功能不育型等[19]。本研究首次在厚軸茶中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象, 對(duì)其花器官發(fā)育過程調(diào)查表明, 雄性不育花和可育花的發(fā)育進(jìn)程基本一致, 經(jīng)歷了花芽分化、花蕾形成、花蕾生長(zhǎng)、花蕾膨大、花蕾露白、花冠展開和花冠脫落7 個(gè)階段。花蕾發(fā)育早期, 雄性不育花雄蕊發(fā)育正常, 花器形狀及大小與可育花無明顯差異?；ɡ侔l(fā)育后期, 雄性不育花花藥排列異常, 花藥發(fā)育開始受阻。展花后, 雄性不育花花絲彎曲, 花藥粘連、干癟、畸形、呈壞死色澤, 不裂藥, 無花粉散出。雄性不育花在花冠大小、花瓣大小和花柱長(zhǎng)度等指標(biāo)上與可育花差異不顯著, 但在花絲長(zhǎng)度、花藥形狀及花藥色澤等方面與可育花存在明顯差異。說明該厚軸茶花瓣和花柱等組織的發(fā)育與其雄性不育性沒有明確的關(guān)系, 而花藥的發(fā)育及花藥外部形態(tài)與其雄性不育性密切相關(guān)。從花器官表型來看, 本研究中獲得的厚軸茶雄性不育材料花器形態(tài)屬于雄蕊萎縮型和花藥異常型。

圖6 雄性不育株M350 花粉母細(xì)胞異常減數(shù)分裂過程Fig. 6 Abnormal meiosis of pollen mother cells of male sterile plant M350

3.2 厚軸茶雄性不育株花藥敗育時(shí)期和特點(diǎn)

植物雄性不育發(fā)生時(shí)期具有多樣性, 不同植物、不同類型及不同來源的雄性不育材料的敗育時(shí)期不一。如花椰菜溫敏雄性不育系花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時(shí)期[20], D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥[21]和楊樹雄性不育品種‘泗楊1 號(hào)’[22]等不育材料的敗育主要發(fā)生在單核時(shí)期。本研究表明, 雄性不育株花藥發(fā)生敗育的時(shí)期和細(xì)胞學(xué)特征較復(fù)雜,同一花蕾及同一花藥內(nèi)敗育進(jìn)程并不完全一致, 花藥和花粉發(fā)育受阻于多個(gè)時(shí)期。部分內(nèi)輪花藥在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期發(fā)育受阻, 形成花粉母細(xì)胞敗育型, 多數(shù)外輪花藥發(fā)育受阻于單核花粉期, 形成單核敗育型, 其敗育發(fā)生的時(shí)期可大體劃分為減數(shù)分裂期、小孢子發(fā)育期和單核花粉期3 個(gè)時(shí)期, 單核花粉期是該厚軸茶雄性不育株花藥和花粉發(fā)生敗育的主要時(shí)期。

表2 可育株M352 和不育株M350 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中異常染色體的頻率Table 2 Frequency of abnormal chromosome behavior in meiosis of fertile plant M352 and male sterile plant M350

圖7 可育株M352 和不育株M350 小孢子發(fā)育過程比較Fig. 7 Comparison of microspores development between fertile plant M352 and male sterile plant M350

3.3 厚軸茶雄性不育株花藥敗育原因

植物雄性不育細(xì)胞生物學(xué)研究表明, 引起花藥和花粉敗育的原因復(fù)雜, 涉及絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、Ca2+濃度、ATP 酶的分布特征、細(xì)胞骨架的排列方式和細(xì)胞程序性死亡等[8]。本研究觀察到厚軸茶雄性不育株的花器官外部形態(tài)發(fā)育異常, 花藥粘連, 藥室扭曲變形。進(jìn)一步對(duì)花藥切片觀察表明, 在花粉母細(xì)胞及之前時(shí)期, 敗育花藥絨氈層發(fā)育正常,與可育花無明顯差異。在減數(shù)分裂時(shí)期, 敗育花藥絨氈層細(xì)胞異常增生、排列混亂, 包圍、擠壓花粉母細(xì)胞。四分體時(shí)期, 敗育花藥絨氈層仍充分發(fā)育,未形成分泌型。單核至雙核花粉期, 敗育花藥絨氈層表現(xiàn)出延遲降解現(xiàn)象。這說明厚軸茶雄性不育株花藥和花粉敗育可能是由于絨氈層細(xì)胞發(fā)育紊亂和延遲降解引起的, 而絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常可能受到花粉囊形態(tài)扭曲、變形的影響, 具體原因還需進(jìn)一步研究。

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂是維持花粉正常發(fā)育的重要過程。前人對(duì)水稻[23]、小麥[24]、百合[25]等不育系材料的研究結(jié)果表明, 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程出現(xiàn)問題, 會(huì)導(dǎo)致花粉敗育。本研究通過染色體壓片法, 觀察到厚軸茶雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中存在環(huán)狀單價(jià)體、滯后染色體、染色體橋、染色體缺失、不均等分離、微核和多分體等較多異?，F(xiàn)象, 其染色體異常頻率達(dá)38.40%, 明顯高于正?？捎甑漠惓ｎl率。說明厚軸茶雄性不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體行為異常可能是導(dǎo)致其花粉敗育的原因之一。

另外, 小孢子和花粉壁發(fā)育異常均會(huì)引起花粉敗育[26]。本研究觀察到厚軸茶雄性不育株四分體分離不完整, 小孢子形狀不規(guī)則, 胞質(zhì)紊亂模糊, 單核期花粉壁皺縮黏連, 成熟花粉生殖核與營(yíng)養(yǎng)核消失, 花粉粒空癟凹陷。一方面可能是由于絨氈層細(xì)胞異常發(fā)育和延遲降解, 不能為小孢子發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 引起小孢子發(fā)育不良; 另一方面也可能是小孢子和花粉壁自身發(fā)育異常, 不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量, 而出現(xiàn)花粉畸形, 最終導(dǎo)致花粉敗育[27]。本研究鑒于熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)厚軸茶雄性不育株花粉細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在差異, 但其敗育的具體原因還有待從花粉超微結(jié)構(gòu)方面觀察確認(rèn)?？傊? 厚軸茶雄性不育株花藥和花粉敗育的可能影響因素主要是絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為異常、小孢子和花粉發(fā)育異常及核質(zhì)互作影響,原因較復(fù)雜, 還需要多方面深入探討和研究。

4 結(jié)論

厚軸茶雄性不育花器形態(tài)屬雄蕊萎縮型和花藥異常型?；ㄋ幇l(fā)育受阻于減數(shù)分裂至單核花粉期,存在花粉母細(xì)胞敗育型和單核敗育型。單核花粉期是其花藥敗育的主要時(shí)期?；ㄋ幗q氈層異常發(fā)育和延遲降解, 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為異常,小孢子和花粉粒發(fā)育異?？赡苁呛褫S茶雄性不育株花藥敗育的主要原因。