大豆GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 基因的克隆及功能探究

李國紀(jì) 朱 林 曹金山 王幼寧

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070

氮素是植物生長所必需的大量元素之一, 其作為重要成分參與核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和磷脂及酶的合成, 在植物生長發(fā)育及光合作用等多個重要過程中氮素都扮演著主要角色。缺乏氮素會顯著影響植物的正常生長, 出現(xiàn)植株矮小和產(chǎn)量降低等諸多現(xiàn)象[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 氮素營養(yǎng)對于糧食生產(chǎn)與農(nóng)業(yè)發(fā)展都具有至關(guān)重要的作用[2]。

植物吸收土壤中的氮素是通過吸收、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)幾個步驟實(shí)現(xiàn)的[3]。植物可以吸收2 種不同形式的氮, 一是無機(jī)氮, 如硝酸鹽和氨鹽等, 二是有機(jī)氮, 如尿素、氨基酸、蛋白質(zhì)等。硝酸鹽和銨鹽是植物根系從土壤中獲得氮素的最主要的2 種形式,植物根毛通過主動運(yùn)輸?shù)姆绞轿詹⒗肗O3-和NH4+, 兩者具有不同的理化性質(zhì), 因而對植物的生長和代謝也會產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)[4-5]。硝酸鹽是植物生長過程中重要的無機(jī)氮源, 它不僅作為植物的營養(yǎng)元素, 調(diào)控葉面積指數(shù)和地上部分干物質(zhì)累積量[6]以及根系發(fā)育等植物生長發(fā)育過程[7-8], 也作為一種信號分子, 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的許多方面, 包括硝酸鹽相關(guān)的基因表達(dá)[9]、根系構(gòu)型[10]、種子休眠[11]、開花時間[12]等。

眾所周知, 豆科作物與其他作物不同, 除可通過主動運(yùn)輸?shù)姆绞轿绽玫貭I養(yǎng)外, 還可通過其根部特化的組織-根瘤進(jìn)行共生固氮(symbiotic nitrogen fixation, SNF), 獲取氮素營養(yǎng)。共生固氮過程是一個非常復(fù)雜的過程, 當(dāng)土壤中氮元素缺乏時,豆科植物的根系會釋放出類黃酮類物質(zhì), 并以此吸引根瘤菌聚集到根系周圍, 根瘤菌受到類黃酮類物質(zhì)的誘導(dǎo)會釋放結(jié)瘤因子(nod factor, NF)。結(jié)瘤因子被豆科植物根部的LysM 型受體激酶NFR 接受并由此激活NF 信號通路。在百脈根(Lotus japonicus)中,結(jié)瘤因子受體為LjNFR1 及LjNFR5 編碼[13-14], 苜蓿(Medicago truncatula) 中 為 MtLYK3/MtLYK4 及MtNFP[15]; 在大豆(Glycine max)中編碼結(jié)瘤因子受體蛋白的同源基因包括GmNFR1α/β及GmNFR5α/β[16-17]。結(jié)瘤因子受體接受NF 后, 啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)和激活質(zhì)膜上的激酶(包括 LjSYMRK、MtDMI2、GmNORK 等), 引起“鈣峰”進(jìn)而導(dǎo)致根瘤菌和植物根系相互作用并形成侵染線。轉(zhuǎn)錄因子NIN 在侵染線和根瘤原基形成過程中起著重要作用,它與NSP1 和NSP2 結(jié)合共同調(diào)節(jié)表皮中的結(jié)瘤基因表達(dá)和結(jié)瘤過程。在豆科植物中相關(guān)基因報(bào)道已有許多, 但大豆中鑒定到的組分還為數(shù)不多, 除了經(jīng)典的ENOD40[18]之外, 近年來miR172c-NNC1[19]、GmEXPB2[20]、GmPT7[21]、GmBEHL1[22]等已被證明參與調(diào)控大豆的結(jié)瘤過程。G-protein 信號通路相關(guān)基因Gα、Gβ、Gγ[23-24]、RGS[24]等也被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)大豆根瘤的發(fā)生發(fā)育。與此同時, 近年來的多項(xiàng)研究結(jié)果證明, 生長素合成與生長素信號通路多個組分參與大豆根瘤形成過程, 例如GmYUC2a[25]、miR393-GmTIR1/GmAFB3[26]、miR160-ARF10/ ARF16/ARF17[27]

和miR167-GmARF8a/GmARF8b[28]等。盡管如此, 對于復(fù)雜的菌植互作、根瘤發(fā)生發(fā)育和共生固氮過程,還需要通過多種技術(shù)手段挖掘其調(diào)控的功能基因,從而全面解析介導(dǎo)大豆共生固氮過程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nitrate transporter, NRT)介導(dǎo)了硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配, NRT 類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要由NRT1 和NRT2 兩個亞家族組成。在擬南芥中,AtNRT1.2屬于NRT1亞家族, 并且由于其表達(dá)不受NO3-的誘導(dǎo), 呈組成型表達(dá)[29-30]。之前我們已經(jīng)對大豆GmNRT1.2s有比較詳細(xì)的生物信息學(xué)分析, 相關(guān)結(jié)果暗示GmNRT1.2s可能參與大豆共生固氮過程。本研究通過對不同組織和不同濃度氮處理下GmNRT1.2a(Glyma.18G126500)和GmNRT1.2b(Glyma.08G296000)[31]的表達(dá)檢測, 并利用大豆毛狀根轉(zhuǎn)化體系研究二者在大豆結(jié)瘤過程中的功能, 證明二者在大豆根系結(jié)瘤過程中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 大豆材料是已經(jīng)完成基因組測序的品種Glycine maxvar. Williams 82, 后文簡稱為W82。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 克隆基因所采用的大腸桿菌(E. coli)菌株是DH5α, 大豆毛狀根轉(zhuǎn)化所用的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)為K599, 大豆慢生型根瘤菌菌株為Bradyrhizobium diaefficiensUSDA 110。載體構(gòu)建涉及到的質(zhì)粒為T 載體Blunt3,基因過表達(dá)載體選用pEGAD。

1.1.3 酶和試劑 KOD plus neo 高保真聚合酶購自TOYOBO, 限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs (NEB), T4 連接酶購自TaKaRa 公司。

利用Adlab 公司的TRI pure 試劑提取總RNA,用購自TaKaRa 公司的RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑完成模板cDNA 的合成, 選用北京天根公司的 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,由上海生工生物公司合成引物, 質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆實(shí)生苗接種根瘤菌處理 將大豆W82種子用70%的酒精滅菌30 s, 于低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石中萌發(fā), 基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方參考之前發(fā)表文章[32],其中以 Ca(NO3)2·4H2O 作為氮源調(diào)整氮濃度至0.25 mmol L-1, 期間以水和低氮營養(yǎng)液交替培養(yǎng)。培養(yǎng)室中, 16 h 光/8 h 暗, 光強(qiáng)140 μmol m-2s-1, 溫度26 ℃, 相對濕度為70%。大豆萌發(fā)15 d 后, 將大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium diaefficiensUSDA 110(OD600為0.08)輕輕澆灌在大豆幼苗根系周圍, 接種量為每棵30 mL, 分別在接菌后10 d 和 28 d 取葉片、根和根瘤樣品, 于液氮中速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 大豆實(shí)生苗氮濃度梯度處理 根據(jù)大豆生長發(fā)育過程的需氮量以Ca(NO3)2·4H2O 作為氮源,分別設(shè)置了無氮(0N, 0 mmol L-1)、低氮(LN, 0.25 mmol L-1)和高氮(HN, 15.75 mmol L-1) 3 個不同濃度的硝酸鹽營養(yǎng)液。將W82 分別種植在含有不同濃度硝酸鹽營養(yǎng)液浸泡的蛭石基質(zhì)中, 期間補(bǔ)充相同濃度營養(yǎng)液保證處理一致性。于萌發(fā)后15 d 取主根和側(cè)根樣品用于后續(xù)表達(dá)檢測。

1.2.3 結(jié)瘤因子提取 結(jié)瘤因子是在宿主植物根系分泌的類黃酮作用下, 根瘤菌合成并分泌的一類多糖信號分子(脂殼寡糖), 可以激活結(jié)瘤因子信號通路。試驗(yàn)中將根瘤菌Bradyrhizobium diaefficiensUSDA 110 在28 ℃, 150 ×g震蕩培養(yǎng), 使OD600達(dá)到0.4～0.6 制成種子液。取5 mL 種子液加入250 mL TY培養(yǎng)基中, 28 ℃ , 150 ×g培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0。加入0.25 mL 5 mmol L-1的染料木黃酮。將菌液7000 ×g離心10 min 去菌體, 上清液經(jīng)1/5 體積正丁醇抽提2 次, 1/10 體積正丁醇抽提1 次, 之后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80℃的條件下蒸干正丁醇, 用2 mL 蒸餾水溶解, 過濾滅菌后4℃黑暗保存。

1.2.4 大豆實(shí)生苗結(jié)瘤因子處理 在接種結(jié)瘤因子的試驗(yàn)中, 首先于低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石中萌發(fā)大豆, 萌發(fā)5 d 后于大豆根部接種1 mL 結(jié)瘤因子, 3 d 后收集根樣品用于分析GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的表達(dá)。分別用1 mL 蒸餾水和1 mL根瘤菌(OD600為0.08)接種的根樣品用作對照, 取樣方法同上。

1.2.5 總RNA 提取及基因表達(dá)檢測 利用TRI pure 試劑提取總RNA, 并且使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑完成模板cDNA 的合成。根據(jù)GmNRT1.2a和GmNRT1.2b基因的 CDS 序列設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR 引物GmNRT1.2a-QF： 5′-TGTTCTTGGCAGGCTCAACT ACT-3′,GmNRT1.2a-QR： 5′-CTTCTGGTTCCTTGTTT GCAAT-3′,GmNRT1.2b-QF： 5′-TTCACTTAACAGTT GCTTCAACAGTAG-3′,GmNRT1.2b-QR： 5′-TCTTA CCCCTTGAGCGTGG-3′。按照北京天根公司的SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒操作說明, 以GmELF1b基因?yàn)閮?nèi)參基因, 引物序列為GmELF1b-QF： 5′-GTTGAAAAGCCAGGGGACA-3′,GmELF1b-QR： 5′-TCTTACCCCTTGAGCGTGG-3′。根據(jù)相對定量法ΔΔCT 公式計(jì)算結(jié)果。

1.2.6 基因克隆及過重組質(zhì)粒構(gòu)建 在構(gòu)建

GmNRT1.2a和GmNRT1.2b過表達(dá)載體的過程中, 自Phytozome 數(shù)據(jù)庫(http：//www.phytozome.net/)獲得GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的CDS 序列, 二者序列長度分別為1758 bp 和1785 bp。選擇植物表達(dá)載體pEGAD 作為GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的過表達(dá)載體, 限制性酶切位點(diǎn)選擇其上多克隆位點(diǎn)中的SmaI和BamHI, 具體引物序列為GmNRT1.2a-F： 5′-TCC CCCGGGATGGAATTAGAACAAAACCAGAG-3′,GmNRT1.2a-R： 5′-CGGGATCCTCAGTTGTTTGTAGT TCCTGTCC-3′,GmNRT1.2b-F： 5′-TCCCCCGGGAT GGAATTAGAACAAAACCAGAG-3′,GmNRT1.2b-R：5′-CGGGATCCTCAGTTGTTGTTTGTAGTTCCTG-3′。以cDNA 為模板擴(kuò)增目的片段(圖1-A), 將目的片段回收純化后連接T 載體進(jìn)行測序。之后將測序正確的目的基因片段通過酶切酶連的方式連入植物表達(dá)載體pEGAD (圖1-B)中, 獲得GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的過表達(dá)載體35S::GmNRT1.2a與35S::GmNRT1.2b。將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 中, 挑取陽性的單克隆接種LB 培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 之后保菌并提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599, 挑取陽性單克隆擴(kuò)繁, 將菌液以1∶1 體積與30%甘油混合, 在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱備用。

(圖1)

圖1 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 過表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 1 Construction of GmNRT1.2a and GmNRT1.2b overexpression vectors

1.2.7 大豆毛狀根轉(zhuǎn)化及根瘤表型觀察 根據(jù)先前描述的方法[33-34]及本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道體系[19], 大豆萌發(fā)3～4 d 后, 將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌K599 在3～4 mL LB 液體培養(yǎng)基中28℃下150 轉(zhuǎn) min-1震蕩培養(yǎng)過夜(OD600為0.8～1.0)。以1∶1000 的比例將液體活化培養(yǎng)后的菌液接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng), 并在培養(yǎng)基中以1∶1000 的比例加入質(zhì)粒及K599 所帶有的抗生素和0.2 mol L-1Acetosyringone (AS), 菌液培養(yǎng)至OD600值約0.8 后,將菌液離心, 棄上清液, 用50 mL 液體共培培養(yǎng)基(CCM)重懸菌液。挑選子葉完整未受損傷的發(fā)芽種子, 用解剖刀從胚軸上切下置于滅過菌的皿中(倒入少量菌液), 在子葉下端的0.1～0.2 cm 下胚軸處切開,切完之后將外植體在菌液中侵染1 h。侵染完成后將外植體放在帶有被CCM 浸濕的濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中, 將其放在暗下共培養(yǎng)3 d 后, 把外植體移到低氮濃度營養(yǎng)液浸泡的蛭石中培養(yǎng), 期間使用低氮營養(yǎng)液與蒸餾水交替培養(yǎng), 10 d 后接種根瘤菌(OD600為0.8～1.0), 每棵接種30 mL, 在接種根瘤菌28 d 后,觀察根瘤表型, 拍照并統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)目, 之后取根樣品進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)水平分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析所用軟件

借助 DNAMAN 7.0 設(shè)計(jì)相關(guān)引物, 使用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)目, 利用SigmaPlot 10.0 軟件分析表達(dá)結(jié)果, 使用SPSS 13.0 分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 的組織表達(dá)模式分析

圖2 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 在大豆不同發(fā)育時期的組織表達(dá)模式分析Fig. 2 Expression pattern of GmNRT1.2a and GmNRT1.2b in different developmental stages of soybean

為了分析GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的組織表達(dá)模式, 將W82 大豆種子種植到用低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石中, 在其生長到15 d 時接種根瘤菌, 分別在接菌后10 d 和28 d 取葉、根和根瘤不同組織的樣品。提取所取樣品 R N A 并反轉(zhuǎn)錄成 c D N A, 對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b基因進(jìn)行組織表達(dá)分析。由圖2 可知,GmNRT1.2a和GmNRT1.2b在葉、根和瘤中均有表達(dá), 且不同組織中表達(dá)量存在較大差異。GmNRT1.2a在10 d 和28 d 材料中有相同的表達(dá)趨勢, 表達(dá)量根中最高, 葉中其次, 根瘤中最低。在28 d 材料的葉、根和根瘤中,GmNRT1.2a的表達(dá)量較其在10 d 材料中均有顯著上升, 在根中表現(xiàn)更為明顯。與此相比, 10 d 和28 d 材料中GmNRT1.2b在葉中表達(dá)量明顯高于根和根瘤中, 而在28 d 材料的葉和根中其表達(dá)量都有明顯下降, 該結(jié)果在葉中表現(xiàn)尤為明顯。

2.2 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 基因受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)

為了驗(yàn)證不同濃度硝酸鹽對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b表達(dá)的影響, 本研究對大豆W82 材料分別進(jìn)行0、0.25 和15.75 mmol L-1硝酸鹽處理。取在不同氮濃度中萌發(fā)15 d 后的主根和側(cè)根的混合樣品,檢測GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的基因表達(dá)。由圖3可知, 與其在無氮營養(yǎng)液中的表達(dá)水平相比, 隨著氮濃度的升高,GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的表達(dá)量有明顯增加。表明GmNRT1.2a和GmNRT1.2b受硝酸鹽尤其是高濃度硝酸鹽的顯著誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 響應(yīng)根瘤菌及結(jié)瘤因子的表達(dá)模式分析

為了分析GmNRT1.2a和GmNRT1.2b是否響應(yīng)根瘤菌侵染, 本研究將W82 材料種植在用低氮營養(yǎng)液浸泡的蛭石中, 于萌發(fā)后5 d 每棵材料接種1 mL結(jié)瘤因子, 并以同時間點(diǎn)接種等體積根瘤菌或蒸餾水作為對照, 在處理3 d 后取主根和側(cè)根的混合樣品, 分別對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b進(jìn)行表達(dá)分析, 并且以之前已報(bào)道的響應(yīng)結(jié)瘤因子信號的GmENOD40-1作為陽性對照。由圖 4 可知,GmENOD40-1同時受到根瘤菌和結(jié)瘤因子誘導(dǎo), 且受根瘤菌誘導(dǎo)更強(qiáng)。GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的表達(dá)同時受到根瘤菌和結(jié)瘤因子誘導(dǎo), 與其對根瘤菌侵染的響應(yīng)模式相比, 二者受結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)更為明顯。推測它們可能通過經(jīng)典的結(jié)瘤因子信號通路響應(yīng)根瘤菌的侵染。

圖3 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 在不同濃度下的硝酸鹽下的表達(dá)模式Fig. 3 Expression pattern of GmNRT1.2a and GmNRT1.2b under different concentrations of nitrate

2.4 過表達(dá)GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 增加根瘤數(shù)目

圖4 GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 響應(yīng)接種根瘤菌和結(jié)瘤因子表達(dá)模式分析Fig. 4 Expression patterns of GmNRT1.2a and GmNRT1.2b in response to rhizobium inoculation and nod factors treatment

為了進(jìn)一步探究GmNRT1.2a和GmNRT1.2b對根瘤數(shù)目的影響, 利用毛狀根轉(zhuǎn)化體系分別將帶有GmNRT1.2a和GmNRT1.2b過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大豆, 以空載體轉(zhuǎn)化作為對照(EV)。在接種根瘤菌28 d后觀察根瘤表型并取樣, 由圖5 可知,GmNRT1.2a或GmNRT1.2b過表達(dá)材料中, 其表達(dá)量同對照相比均顯著升高(圖5-A, B)?？蛰d體對照(EV)轉(zhuǎn)化的毛狀根的根瘤平均數(shù)目為15.38, 而在過表達(dá)GmNRT1.2a與GmNRT1.2b的陽性毛狀根中, 其平均結(jié)瘤數(shù)分別為39.60 個與24.63 個(圖5-C, D)。說明低氮條件下過表達(dá)GmNRT1.2a或GmNRT1.2b都可以極大地增加大豆根瘤數(shù)目, 其中過表達(dá)GmNRT1.2a根瘤數(shù)目增加更明顯, 表明GmNRT1.2a及GmNRT1.2b可能正向調(diào)控大豆結(jié)瘤。

圖5 在低氮培養(yǎng)條件下過表達(dá)GmNRT1.2a 或GmNRT1.2b 增加結(jié)瘤數(shù)目Fig. 5 Nodule number increased by 35S::GmNRT1.2a or 35S::GmNRT1.2b under low nitrate condition

3 討論

近年來, 有關(guān)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與氮素營養(yǎng)吸收的研究已成為熱點(diǎn)。目前的研究主要集中在擬南芥[35]、水稻[36-39]、番茄[40]、小麥[41]、油菜[42]等植物, 對于大豆中該類蛋白的功能研究報(bào)道較少, 尚處于起步階段。由于物種的特異性, 不同物種的同源基因之間可能存在著功能的分化。大豆GmNRT1.2s的相關(guān)生物信息學(xué)分析結(jié)果也顯示, 大豆GmNRT1.2s的堿基和氨基酸序列與擬南芥中的NRT1.2 存在一定差異[31]。另外, 擬南芥中ATNRT1.2s為組成型表達(dá), 即不受硝酸鹽的誘導(dǎo)[29-30], 而本研究中發(fā)現(xiàn)大豆GmNRT1.2a和GmNRT1.2b同時受到低濃度和高濃度硝酸鹽誘導(dǎo)。除此之外, 大豆GmNRT1.2a在根中表達(dá)量最高,而GmNRT1.2b主要在葉中表達(dá), 二者主要的表達(dá)部位有著明顯的不同, 這一差異也在一定程度上暗示著二者可能在某些功能上存在差異。

相關(guān)研究結(jié)果證明,GmNRT1.2a和GmNRT1.2b過表達(dá)后導(dǎo)致大豆的根瘤數(shù)目均顯著增加, 但是對于GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的功能研究尚不完全。在之后的研究中可以利用RNA 干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)和 CRISPR 基因編輯技術(shù)對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的功能進(jìn)行深入探究, 建立快速穩(wěn)定的RNAi 與CRISPR 大豆毛狀根轉(zhuǎn)化體系, 對進(jìn)一步研究GmNRT1.2a和GmNRT1.2b在結(jié)瘤過程中的作用具有重要意義。

基于大豆GmNRT1.2a和GmNRT1.2b受高濃度硝酸鹽誘導(dǎo), 并且在接種根瘤菌和結(jié)瘤因子后表達(dá)上調(diào), 推測它們可能受某些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控, 后續(xù)研究可以通過生物信息學(xué)分析預(yù)測其上游轉(zhuǎn)錄因子,并通過酵母單雜技術(shù)進(jìn)行文庫篩選候選的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步利用ChIP-PCR 與EMSA 技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b的調(diào)控。為了完善對GmNRT1.2a和GmNRT1.2b調(diào)控大豆結(jié)瘤的分子機(jī)制研究, 還可以開展其互作蛋白的預(yù)測及鑒定, 例如, 通過string 10 (https：//string-db.org/)網(wǎng)站進(jìn)行互作預(yù)測, 同時利用酵母雙雜交及IP-MS 大規(guī)模尋找可能與GmNRT1.2a 和GmNRT1.2b 互作的蛋白, 從而更深入地解析GmNRT1.2a和GmNRT1.2b調(diào)控大豆結(jié)瘤的分子網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié)論

GmNRT1.2a和GmNRT1.2b分別在大豆根和葉中表達(dá)最高。GmNRT1.2a和GmNRT1.2b受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá), 且顯著響應(yīng)根瘤菌及結(jié)瘤因子處理。在毛狀根轉(zhuǎn)化體系中, 過表達(dá)GmNRT1.2a和GmNRT1.2b使大豆根瘤數(shù)目顯著增加, 表明GmNRT1.2a和GmNRT1.2b在結(jié)瘤過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用。