血清ctDNA、CA72-4及CEA水平與胃癌患者化療療效的關(guān)系研究*

劉 靜,鄂緯建,常 璠,紀(jì)榮祖

(1.青海省西寧市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810005；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810001)

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均占我國惡性腫瘤的第2位[1]。2015年相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年胃癌新發(fā)病例數(shù)為67.9萬，死亡病例數(shù)為49.8萬，分別占全球的42.6%和45.0%[2]。但我國胃癌早期診治率低于10%，約90%的胃癌患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，此時(shí)手術(shù)后5年生存率低于30%[3-4]?；熗ǔＷ鳛檫M(jìn)展期胃癌的主要治療手段，但目前缺乏預(yù)測化療預(yù)后的敏感生物標(biāo)志物[5]。雖然有研究表明，糖鏈抗原72-4(CA72-4)和癌胚抗原(CEA)是診斷胃癌靈敏度較高的生物標(biāo)志物，但關(guān)于其對胃癌化療療效評價(jià)方面的研究較少[5-8]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道將循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(ctDNA)應(yīng)用于腫瘤放化療療效評價(jià)，ctDNA被稱為“液態(tài)活檢”，具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。本研究探討了血清ctDNA、CA72-4和CEA水平與胃癌患者化療療效的關(guān)系及其在化療療效判斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年10月至2013年2月在西寧市第三人民醫(yī)院接受根治性遠(yuǎn)端胃大部切除術(shù)，并進(jìn)行術(shù)后化療的早期胃癌患者30例作為研究對象。所有患者均經(jīng)胃鏡檢查及病理活檢確診為早期胃癌，其中男19例，女11例；年齡35～78歲，平均(53±8)歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期9例；腫瘤直徑>5 cm者10例，≤5 cm者20例；分化型7例，未分化型23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：卡氏評分>60分；第1次接受化療；能耐受全身靜脈化療且均能接受2個(gè)療程以上治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾??；既往接受過化療；對化療藥物過敏；合并腫瘤轉(zhuǎn)移；治療依從性差。本研究經(jīng)西寧市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2化療方案 所有患者術(shù)后第4周給予DCF改良方案化療。第1天靜脈滴注多西他賽(江蘇恒瑞醫(yī)藥，批號(hào):171109AF)75 mg/m2；第2天靜脈滴注奧沙利鉑(南京制藥廠有限公司，批號(hào):201711112)130 mg/m2；第1～14天口服替吉奧膠囊(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，批號(hào):023170308)80 mg/(m2·d)，分早晚服用，然后停藥7 d再進(jìn)行第2個(gè)療程。21 d為1個(gè)療程，連續(xù)治療2個(gè)療程。

1.3血清ctDNA、CA72-4和CEA檢測 分別于術(shù)后化療前和化療療程結(jié)束時(shí)收集患者清晨空腹靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離得到血清，-20 ℃保存待測。

1.3.1采用RT-PCR檢測血清ctDNA水平 量取血清750 μL，加入750 μL磷酸鹽緩沖液，混勻，95 ℃孵育10 min，16 000×g 離心10 min，取上清液，-80 ℃保存，備用。將PCR反應(yīng)液(Super green 1.0 μL，PCR正向引物0.5 μL，PCR反向引物0.5 μL，Master 10.0 μL，H2O 6.0 μL，DNA模板2.0 μL)加入PCR擴(kuò)增板內(nèi)，蓋上透明膜，輕輕混勻，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測品孔。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min 1次，95 ℃ 10 s 45次，60 ℃ 20 s 45次，72 ℃ 20 s 45次。擴(kuò)增結(jié)束后，檢測 Ct值，以標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入待測品Ct值計(jì)算得到ctDNA水平。

1.3.2血清CA72-4、CEA水平檢測 CA72-4和CEA ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，檢測過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測品孔和空白孔，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測品孔加待測標(biāo)本50 μL；標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測品孔中分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，封板膜封板后37 ℃孵育60 min；棄去液體，吸水紙吸干后用350 μL洗滌液洗滌5次，吸水紙吸干；每孔加底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加終止液50 μL，于450 nm波長下檢測各孔吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值和水平做標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入待測品吸光度值，即可計(jì)算出待測品中CA72-4、CEA水平。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：ctDNA>87.12 μg/L為陽性，≤87.12 μg/L為陰性；CA72-4>4.25 μg/L為陽性，≤4.25 μg/L為陰性；CEA>2.41 μg/L為陽性,≤2.41 μg/L為陰性。

1.4療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1腫瘤標(biāo)志物療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)腫瘤標(biāo)志物療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]，完全緩解(CR)：升高的腫瘤標(biāo)志物水平恢復(fù)正常且維持4周以上；部分緩解(PR)：升高的腫瘤標(biāo)志物水平下降≥65%，并維持4周以上；疾病穩(wěn)定(SD)：升高的腫瘤標(biāo)志物水平下降<65%或腫瘤標(biāo)志物水平升高<40%；疾病進(jìn)展(PD)：腫瘤標(biāo)志物水平升高≥40%或從正常水平到超過正常水平，或升高的腫瘤標(biāo)志物水平未降至正常值10倍以下。

1.4.2客觀療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 按照RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)[12]評估患者療效。CR：所有病灶均消失不見；PR：基線病灶最大徑之和減少30%以上；SD：基線病灶最大徑之和有減少但未達(dá)PR，或有增加但未達(dá)PD；PD：基線病灶最大徑之和至少增加20%或出現(xiàn)新病灶。經(jīng)化療后客觀療效評價(jià)，本研究納入的30例患者中，CR患者10例，PR患者9例，SD患者6例，PD患者5例。

1.4.3有效、無效判斷 以上兩種評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)均根據(jù)療效將CR、PR界定為有效，將PD、SD界定為無效。

1.4.4預(yù)后評價(jià) 化療結(jié)束后對所有患者進(jìn)行為期5年的隨訪，以5年生存人數(shù)和總生存率作為最終遠(yuǎn)期預(yù)后評價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1不同客觀療效患者化療前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比較 化療后CR和PR患者ctDNA、CA72-4和CEA水平與化療前比較均明顯降低(P<0.05)；SD和PD患者中，ctDNA水平化療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CA72-4和CEA水平化療后與化療前比較均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 不同客觀療效患者化療前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比較

2.2腫瘤標(biāo)志物療效與客觀療效評價(jià)一致性結(jié)果 ctDNA、CA72-4、CEA聯(lián)合檢測的療效評價(jià)符合率為93.33%，明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測的符合率(P<0.05)；且3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的Kappa值為0.71，吻合度較強(qiáng)，一致性較好；ctDNA、CA72-4、CEA單獨(dú)檢測的Kappa值分別為0.37、0.31、0.12，吻合度均較弱，見表2。

表2 腫瘤標(biāo)志物療效與客觀療效評價(jià)一致性結(jié)果

續(xù)表2 腫瘤標(biāo)志物療效與客觀療效評價(jià)一致性結(jié)果

注：與ctDNA+CA72-4+CEA比較，*P<0.05。

2.3ctDNA、CA72-4、CEA對胃癌化療療效的評估價(jià)值及與化療預(yù)后的關(guān)系 ROC曲線分析結(jié)果顯示，以客觀療效評價(jià)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，ctDNA、CA72-4、CEA聯(lián)合檢測評估胃癌化療療效的靈敏度為94.74%，特異度為90.91%，曲線下面積(AUC)為0.915，均高于3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測，見表3。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA陰性患者總生存率均明顯高于陽性患者(χ2=5.625，P=0.018；χ2=4.073，P=0.044；χ2=4.344，P=0.037)，見圖1。

注：A為CEA的Kaplan-Meier生存曲線；B為CA72-4的Kaplan-Meier生存曲線；C為ctDNA的Kaplan-Meier生存曲線。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線

表3 ctDNA、CA72-4、CEA單獨(dú)及聯(lián)合檢測對胃癌化療療效的評估價(jià)值

注：—為無數(shù)據(jù)。

2.4胃癌患者化療預(yù)后的影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑、分化程度、ctDNA、CA72-4和CEA對患者化療預(yù)后有影響(P<0.05)，見表4。將對化療預(yù)后有影響的因素納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA是影響胃癌患者化療預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見表5。

表4 影響胃癌患者化療預(yù)后的單因素分析

續(xù)表4 影響胃癌患者化療預(yù)后的單因素分析

表5 影響胃癌患者化療預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

腫瘤標(biāo)志物是可以反映腫瘤生長轉(zhuǎn)移的一類物質(zhì)。研究顯示，腫瘤標(biāo)志物與腫瘤增殖和腫瘤細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)[7]，提示通過檢測腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平可以評估腫瘤治療效果和預(yù)后。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有高特異度、高靈敏度、便于檢測等特點(diǎn)，然而單一腫瘤標(biāo)志物特異度、靈敏度低，現(xiàn)在多建議采用多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合及動(dòng)態(tài)檢測[13]。

CEA是一種腫瘤細(xì)胞表面抗原，所有內(nèi)胚層來源腫瘤均可見CEA表達(dá)異常，其主要用于消化道腫瘤檢測。CA72-4是一種高分子糖蛋白類癌胚抗原，是檢測胃癌的首選腫瘤標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者化療后CEA、CA72-4水平較化療前明顯降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胃癌患者CEA水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)[14-16]。本研究結(jié)果顯示，胃癌化療后客觀療效為CR和PR的患者CEA和CA72-4水平較化療前明顯降低且恢復(fù)至正常水平范圍內(nèi)，而客觀療效為SD和PD患者的血清CEA和CA72-4水平較化療前明顯升高，提示CEA、CA72-4可以作為胃癌療效評價(jià)的重要參考指標(biāo)。本研究進(jìn)一步分析了CEA和CA72-4評價(jià)化療療效的價(jià)值，將其與客觀療效評價(jià)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CEA和CA72-4評價(jià)結(jié)果與客觀療效評價(jià)結(jié)果的符合率分別為56.67%和66.67%，Kappa值分別為0.12和0.31，提示CEA和CA72-4單獨(dú)應(yīng)用評價(jià)胃癌化療療效價(jià)值較低，分析其原因可能與以下因素相關(guān)：CEA或CA72-4可以與血液中其他抗原相互結(jié)合，導(dǎo)致部分胃癌患者接受化療后會(huì)出現(xiàn)短暫、可恢復(fù)的CEA水平升高[17]，從而影響結(jié)果判斷，導(dǎo)致與客觀療效的評價(jià)符合率較低，提示CEA和CA72-4水平的升高并不一定存在腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可能是這部分患者對化療的短暫反應(yīng)。基于此，SORBYE等[18]也建議不應(yīng)單獨(dú)依據(jù)CEA或CA72-4水平來評價(jià)胃癌患者化療療效。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞和ctDNA被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物，對預(yù)后判斷具有一定的指導(dǎo)意義[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，ctDNA可以作為監(jiān)測胃癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物，是整體生存率及無進(jìn)展生存率的預(yù)測因素之一[20]； 還有文獻(xiàn)報(bào)道，ctDNA可以用于多種腫瘤包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等的預(yù)后和療效評估[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌化療后客觀療效為CR和PR的患者ctDNA水平較化療前明顯降低且恢復(fù)至正常水平范圍內(nèi)，客觀療效為SD和PD的患者ctDNA水平較化療前比較無明顯變化，提示ctDNA水平可以作為胃癌化療療效評價(jià)的指標(biāo)。進(jìn)一步對ctDNA評價(jià)胃癌化療療效與客觀療效結(jié)果的一致性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者療效評價(jià)符合率為73.33%，吻合度較弱(Kappa值為0.37)，分析其原因：腫瘤細(xì)胞被機(jī)體自然殺傷細(xì)胞吞噬而導(dǎo)致血液中殘留的ctDNA水平較低；但ctDNA檢測結(jié)果易受到采血時(shí)間、飲食、個(gè)體差異等因素影響，導(dǎo)致檢測水平波動(dòng)較大，從而影響對化療療效的評價(jià)[23-24]。

本研究將ctDNA、CA72-4和CEA 3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA聯(lián)合檢測評價(jià)的胃癌化療療效結(jié)果與客觀療效結(jié)果的符合率為93.33%，吻合度較強(qiáng)(Kappa值為0.71)，提示3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測在胃癌療效評價(jià)中具有重要價(jià)值。

為了進(jìn)一步評價(jià)ctDNA、CA72-4和CEA水平對胃癌化療療效的評估價(jià)值，本研究進(jìn)行了ROC曲線分析，結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4、CEA聯(lián)合檢測對胃癌化療療效評估的靈敏度、特異度和AUC均高于3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測，提示3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可以有效評估胃癌化療療效，指導(dǎo)臨床治療。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA陰性患者總生存率均明顯高于陽性患者，提示上述3項(xiàng)指標(biāo)可以作為評價(jià)胃癌遠(yuǎn)期預(yù)后的重要參考指標(biāo)。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，ctDNA、CA72-4和CEA是影響胃癌化療患者預(yù)后的獨(dú)立因素。此外，由于本研究納入的病例為早期胃癌患者，并未發(fā)現(xiàn)年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期和分化程度對胃癌化療療效的獨(dú)立影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，血清ctDNA、CA72-4和CEA聯(lián)合檢測對于早期胃癌化療的遠(yuǎn)期療效預(yù)測具有較高準(zhǔn)確性，其療效評價(jià)與客觀療效評價(jià)結(jié)果一致性較好。但是由于本研究納入的病例數(shù)較少，結(jié)果的可靠性和科學(xué)性還需要后續(xù)積累樣本量以進(jìn)一步驗(yàn)證。