霜凍前后野生余甘子果實功能成分的變化

趙瓊玲，張永輝，羅會英，金 杰，何 璐，袁建民， 瞿文林，沙毓滄

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；b.園藝作物研究所，云南 昆明 650001； 2.元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

余甘子Phyllanthus emblica為大戟科葉下珠屬植物，又名滇橄欖，其果實入口苦澀，回味甘甜，故名“余甘”。余甘子果實性涼，味甘，酸澀，具有清熱涼血、消食健胃、生津止渴的功效。臨床醫(yī)學(xué)研究結(jié)果證明，余甘子果實具有抗腫瘤，抗衰老[1]，抗病原微生物，降血脂和血壓，促使排鉛，治療糖尿病，控制和治療膽道疾病[2]，消炎消毒，止瀉止痛，治療血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干[3]的作用，是衛(wèi)生部審核頒布的“藥食同源”植物[4]。

余甘子果實富含酚酸類化合物（沒食子酸、單寧）[5]、黃酮[6]、多糖、維生素C、SOD、氨基酸等成分，營養(yǎng)豐富。目前，余甘子果實營養(yǎng)成分的形成及積累變化機制已成為種質(zhì)資源學(xué)及藥食同源植物研究的熱點。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，余甘子果實營養(yǎng)成分的形成及積累變化與來源地有關(guān)。陳曉蘭等[7]比較了不同產(chǎn)地余甘子果實的多糖含量，發(fā)現(xiàn)廣州余甘子果汁中多糖含量最高；趙瓊玲等[8]對余甘子成熟果實氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的余甘子果實的氨基酸組成和含量有較大差異。另一方面，余甘子果實營養(yǎng)成分的形成及積累變化與其成熟過稱有關(guān)。陳貴清等[9]觀測同一余甘子植株果實成熟過程中內(nèi)含物變化，發(fā)現(xiàn)維生素C 和糖含量在翌年3月上旬達最大值，有機酸含量在翌年1月呈下降趨勢，單寧含量變化規(guī)律不明顯，纖維素含量在整個果實成熟期變化不大；趙虹等[10]對同一地點3 株余甘子植株不同成熟期果實主要成分進行研究，發(fā)現(xiàn)維生素C 和SOD 含量在每年11月初至翌年2月初含量最高，總糖含量在翌年2月后達最高。從以上研究結(jié)果來看，余甘子果實營養(yǎng)成分的形成在較大程度上受到種質(zhì)區(qū)位和植株生長發(fā)育時間的影響。區(qū)位和植株生長發(fā)育的差異，很大程度上是對區(qū)域氣候差異的響應(yīng)，李昆等[11]進行了不同省份余甘子果實形態(tài)和營養(yǎng)成分分析，認(rèn)為氣溫有可能是影響余甘子果實營養(yǎng)成分積累的主要因素。在生產(chǎn)實踐中，立秋后余甘子果實進入成熟期，大量鮮果上市，而立冬后采收的果實更甘甜，味道更好。由于立秋至立冬期間普遍存在降溫乃至霜凍情況，溫度的變化，特別是低溫過程可能對余甘子果實風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生了影響，但目前鮮見立秋至立冬后降溫過程對余甘子果實主要營養(yǎng)物質(zhì)含量變化影響的相關(guān)研究報道。

云南永仁素有“太陽城”之稱，光照充足，立秋后該區(qū)域余甘子果實普遍成熟，當(dāng)?shù)赜薪禍厮獌龊蟛墒沼喔首庸麑嵉牧?xí)俗，是研究降溫后余甘子果實營養(yǎng)物質(zhì)的變化和特色余甘子種質(zhì)風(fēng)味形成的較好的試驗場所。本研究中以立秋、立冬2 個節(jié)氣為觀測時間點，采集永仁同一地點同一居群的野生余甘子果實，對其蛋白質(zhì)含量、SOD 活性、氨基酸含量、維生素C 含量、總糖含量、總酸含量、總酚含量、硒含量進行測定和比較，明確以霜凍為特征的降溫過程中余甘子果實營養(yǎng)物質(zhì)的積累及變化特征，以期為余甘子果實風(fēng)味形成機制的研究提供數(shù)據(jù)，為余甘子果實的采收和加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

云南楚雄州永仁縣位于東經(jīng)101°14′—101°49′，北緯25°51′—26°30′，年均日照達2 824.4 h，年均氣溫17.8 ℃，年均降水量840 mm。取樣地點為永仁縣的野生余甘子林，選取同一居群生長狀況基本一致的7 株代表性植株（YR01、YR02、YR03、YR05、YR06、YR07、YR08）作為研究樣本進行采樣觀測。2018年，在果實成熟時進行第1 次采果（立秋，8月），霜凍后進行第2 次采果（立冬，10月）。2018年永仁地區(qū)全年氣溫變化情況如圖1 所示，8月后最高溫值及最低溫值均出現(xiàn)明顯下降，10月明顯出現(xiàn)霜降氣候，其中4月為余甘子果實初果期，5月至立秋前為果實膨大期，立秋后為果實成熟期。

圖1 2018年云南永仁縣各月平均氣溫的變化Fig.1 Mean monthly temperature changes of Yongren county of Yunnan in 2018

1.2 測定項目和測定方法

采用隨機抽樣的方法，按每株樹冠外層?xùn)|西南北4 個方向的上中下位置摘取果實。從所摘果實中隨機選取10 個果實，利用游標(biāo)卡尺測定果實橫縱徑、果肉厚，用電子天平（精度為0.001）測定單果質(zhì)量、果核質(zhì)量，取平均值。取果肉進行室溫勻漿，各稱取0.1 g，待測。

采用微量法測定維生素C 的氧化速率，計算維生素C 含量；采用微量法測定蛋白質(zhì)含量；使用紫外分光光度計測定570 nm 處吸光值，計算氨基酸含量；用超聲提取法進行提取，使用分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，測定760 nm 處吸光值，計算總酚含量；用蒽酮比色法測定總糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Office Excel 2003 軟件整理數(shù)據(jù)，使用SAS 軟件進行單因素方差分析及指標(biāo)間相關(guān)性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜凍前余甘子果實形態(tài)和功能成分

2.1.1 霜凍前果實形態(tài)和功能成分指標(biāo)

霜凍前（立秋）余甘子果實的形態(tài)及功能成分含量或活性見表1。由表1 可知，霜凍前余甘子YR05 樣株的果實橫徑顯著大于YR06、YR07樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR07 樣株果實縱徑顯著大于YR01、YR05 樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR05 樣株單果質(zhì)量顯著高于YR06、YR07 樣株，與其他樣株差異不顯著（P＞0.05）；YR06 樣株果肉厚顯著大于YR03、YR05、YR08 樣株（P＜ 0.05）；YR02 樣株果核質(zhì)量顯著大于YR05 樣株（P＜0.05）。

果實化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，霜凍前余甘子果實蛋白質(zhì)含量平均值為294.85 mg/g，YR02 樣株果實蛋白質(zhì)含量最高，YR01 樣株含量最低，YR02 和YR05 樣株果實蛋白質(zhì)含量極顯著高于YR01、YR03、YR06、YR07、YR08 樣株（P＜0.01），變異系數(shù)為25.31。YR06 樣株果實的SOD 活性最高，為356.29 U/g，YR02 樣株最低，為242.08 U/g。果實SOD 活性平均值為297.38 U/g，高于均值的樣株有YR01、YR03、YR06、YR07，其中YR06樣株極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實氨基酸含量平均值為28.06 μmol/g，含量最高為YR06樣株，最低為YR05 樣株，YR06 樣株果實氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實維生素C 含量平均值為1 084.8 nmol/g，最高為YR01樣株，其含量為1 739.12 nmol/g，最低為YR02樣株，其含量為817.42 nmol/g，YR01 樣株果實維生素C含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實總糖含量平均值為48.13 mg/g，含量最高為YR02 樣株，含量最低為YR01 樣株，YR02 樣株果實總糖含量與YR05 樣株差異不顯著（P＞0.05），與其他樣株差異極顯著（P＜0.01）。果實總酸含量平均值為4.28%，最高為YR02 樣株，最低為YR05 樣株，YR02 樣株果實總酸含量極顯著高于其他樣株 （P＜0.01）。果實總酚含量平均值為22.88 mg/g，最高為YR02 樣株，最低為YR01 樣株，YR02 樣株果實總酚含量與YR05、YR08 樣株差異不顯著 （P＞0.05）。果實硒含量平均值為51.08 μg/kg，最高為YR03 樣株，最低為YR08 樣株，YR03 樣株果實硒含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。所測指標(biāo)中變異系數(shù)最大的是硒含量，其次為單果質(zhì)量、氨基酸含量、維生素C 含量。

2.1.2 霜凍前果實形態(tài)和功能成分指標(biāo)間的相關(guān)性

霜凍前余甘子果實各指標(biāo)間的相關(guān)性見表2。由表2 可知，單果質(zhì)量與果肉厚、果實橫徑呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），與果實縱徑呈顯著相關(guān) （P＜0.05）；果肉厚與果實橫徑呈極顯著相關(guān)（P＜ 0.01）；果實蛋白質(zhì)含量與維生素C 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與果實總糖含量、總酚含量極顯著相關(guān)（P＜0.01）；果實維生素C 含量與總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；單果質(zhì)量、果實橫徑與果實SOD 活性呈顯著相關(guān)；果肉厚與果實硒含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 霜凍前余甘子果實的形態(tài)及功能成分含量或活性?Table 1 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits before frost

表2 霜凍前余甘子果實各指標(biāo)間相關(guān)性?Table 2 Correlation between indexes in P.emblica fruits before frost

2.2 霜凍后余甘子果實形態(tài)和功能成分

2.2.1 霜凍后果實形態(tài)和功能成分指標(biāo)

霜凍后（立冬）余甘子果實的形態(tài)及功能成分含量或活性見表3。由表3 可知，YR05 樣株的果實橫徑顯著大于YR01、YR02、YR06、YR07、YR08 樣 株（P＜0.05），YR08樣株的果實縱徑顯著大于其他樣株（P＜0.05）；YR08樣株單果質(zhì)量顯著高于YR01、YR02、YR03、YR07 樣株（P＜0.05）；YR05 樣株果肉厚顯著大 于YR01、YR02、YR05、YR07、YR08 樣株（P＜0.05）；YR06 樣株果核質(zhì)量顯著大于其他樣株（P＜0.05）。

表3 霜凍后余甘子果實的形態(tài)及功能成分含量或活性Table 3 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits after frost

果實化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，余甘子果實蛋白質(zhì)含量平均值為329.93 mg/g，高于均值的樣株有YR02、YR05、YR06、YR07，其中YR05 樣株果實蛋白質(zhì)含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。YR01 樣株果實SOD 活性最高，為316.86 U/g， YR02樣株最低， 為237.54 U/g， 平均值為 269.23 U/g，高于均值的樣株有YR01、YR07、YR08，其中YR01 樣株果實SOD 活性極顯著高于YR02、YR03、YR05、YR06、YR07 樣株（P＜0.01）。果實氨基酸含量平均值為36.97 μmol/g，含量最高為YR06 樣株，最低為YR08 樣株，YR06 樣株果實氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實維生素C 含量平均值為1 074.53 nmol/g，YR06 樣株最高，含量為1 059.89 nmol/g，YR02樣株含量最低，為643.43 nmol/g，YR01 樣株果實氨基酸含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。果實總糖含量平均值為52.97 mg/g，含量最高為YR02 樣株，含量最低為YR08 樣株。果實總酸含量平均值為3.71%，最高為YR08 樣株，最低為YR02 樣株。果實平均總酚含量為23.00 mg/g，最高為YR02 樣株，最低為YR03 樣株。果實硒含量平均值為19.26 μg/kg，最高為YR03 樣株，最低為YR06 樣株，YR03 樣株果實硒含量極顯著高于其他樣株（P＜0.01）。所測指標(biāo)中，變異系數(shù)最大的為氨基酸含量，其次為硒含量。

2.2.2 霜凍后果實形態(tài)和功能成分指標(biāo)間的相關(guān)性

霜凍后余甘子果實各指標(biāo)間的相關(guān)性見表4。由表4 可知，果肉厚與果實橫徑呈極顯著相關(guān) （P＜0.01）；單果質(zhì)量與果實橫徑呈顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果核質(zhì)量與果實縱徑呈顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果實維生素C 含量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總酸含量顯著相關(guān)（P＜ 0.05）；果實總糖含量與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；果實縱徑與總酸含量呈顯著相關(guān) （P＜0.05）。

2.3 霜凍前后余甘子果實功能成分的變化

通過比較表1 和表3 中數(shù)據(jù)可知，霜凍前后余甘子果實的功能成分的含量或活性發(fā)生了顯著變化。霜凍后，果實蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖、總酚含量均增加。其中，氨基酸含量由28.06 μmol/g增大到36.97 μmol/g；總糖含量由48.13 mg/g 增加到52.97 mg/g；蛋白質(zhì)含量由294.85 mg/g 增大到329.93 mg/g，增幅最大；總酚含量均值變化最小，由霜凍前的22.88 mg/g 變?yōu)?3.00 mg/g。另一方面，霜凍后余甘子果實SOD 活性由297.38 U/g 降低到269.23 U/g；維生素C 含量由1 084.80 nmol/g 降低到887.82 nmol/g；總酸含量由4.28%降低到3.71%；硒元素含量由51.08 μg/kg 降低到19.26 μg/kg。結(jié)果表明，霜凍有改變余甘子果實營養(yǎng)物質(zhì)形成或積累的作用。

表4 霜凍后余甘子果實各指標(biāo)間的相關(guān)性Table 4 Correlation between indexes in P.emblica fruits after frost

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，霜凍有改變余甘子果實營養(yǎng)物質(zhì)形成或積累的作用。霜凍前，果實SOD活性、維生素C 含量、硒含量較高，可根據(jù)生產(chǎn)利用決定其采收期。單果質(zhì)量、果實橫徑與果實SOD 活性呈顯著相關(guān)，果肉厚與硒含量呈顯著相關(guān)，在野外采果的時候可作為參考依據(jù)。霜凍后，果實蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖含量較高，這個階段的果實口感較好。果實維生素C 含量與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與總酸含量顯著相關(guān)；總糖含量與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；果實的縱徑與總酸含量呈顯著相關(guān)。因此，瓜形果實的總酸含量較低，口感較好，這對野外資源收集有一定的參考作用。

氣候?qū)χ参锕麑崰I養(yǎng)物質(zhì)的形成和積累具有重要作用，其中溫度是重要的指標(biāo)之一。如年極端最高氣溫升高會降低油茶鮮果的含油量[12]。本研究結(jié)果表明，余甘子果實的橫徑、縱徑、單果質(zhì)量、果肉厚、果核質(zhì)量等指標(biāo)在霜凍前后存在顯著差異，這一結(jié)果表明霜凍后余甘子果實生長模式發(fā)生了變化。同時，同一居群余甘子果實形態(tài)有不同程度的差異，這一結(jié)論與瞿文林等[13]認(rèn)為余甘子果實表型性狀在居群內(nèi)存在著豐富的變異相吻合。霜凍后，余甘子果實的蛋白質(zhì)、氨基酸、總糖和總酚含量增加，維生素C、硒和總酸含量減少，SOD 活性極顯著降低，表明低溫會導(dǎo)致余甘子果實化合物積累模式發(fā)生改變。郭蘭萍等[14]認(rèn)為植物化學(xué)表型形成的機制是遺傳變異與環(huán)境飾變的共同作用。控制植物化學(xué)表型的功能基因存在于核基因中，核基因在居群間通過種子流和花粉流傳遞。余甘子為雌雄同株異花，種子傳播范圍有限，群體間地理間隔較大，不同居群間進行基因流的機會少[15]，而同一居群內(nèi)基因交流多，這可能是導(dǎo)致本研究中余甘子果實化學(xué)類營養(yǎng)物質(zhì)含量差異的又一重要原因。一般認(rèn)為，SOD 活性降低表明果實體內(nèi)清除自由基的能力減弱，此時果實體內(nèi)代謝平衡受阻，膜系統(tǒng)功能及結(jié)構(gòu)受到破壞[16-17]。本試驗結(jié)果表明，霜凍后余甘子果實SOD 活性極顯著降低，說明霜凍過程對余甘子果實的生長發(fā)育具有破壞性作用，但這種破壞作用對余甘子風(fēng)味形成的作用尚不明了。此外，鐘振國等[18]對我國不同產(chǎn)區(qū)余甘子果實的沒食子酸含量進行測定，發(fā)現(xiàn)云南產(chǎn)區(qū)余甘子果實的沒食子酸含量均高于其他地區(qū)。由于云南山地立體氣候明顯，相對多變的環(huán)境條件可能與這些次生代謝物的形成和積累關(guān)系密切。在后續(xù)的研究中，生物氣候指標(biāo)與余甘子沒食子酸等特殊化合物的形成及積累間關(guān)系的研究應(yīng)得到重視。

霜凍前余甘子果實蛋白質(zhì)含量與維生素C、總糖、總酚含量極顯著相關(guān)，霜凍后余甘子果實維生素C 含量與總糖含量極顯著相關(guān)，總糖含量與總酸含量極顯著負(fù)相關(guān)，這可能與低溫對植物光合作用過程的影響有關(guān)。蘇文華等[19]認(rèn)為光合作用過多積累的碳，用于合成酚類等以碳為基礎(chǔ)的次生代謝物質(zhì)就會增多，含氮的次生代謝產(chǎn)物減少。低溫對氮代謝有深刻影響，低溫脅迫下，由于降解速率下降或合成加強，植物可溶性蛋白含量增加[16]。在正常情況下，植物體內(nèi)游離氨基酸含量較低[20]，而在低溫脅迫條件下，游離氨基酸含量迅速上升[21]，這可能是造成本研究中霜凍后余甘子果實氨基酸含量顯著升高的原因。此外，霜凍后余甘子果實總糖含量顯著高于霜凍前，而總酸含量顯著低于霜凍前，且霜凍后余甘子果實總糖含量與總酸含量有極顯著的相關(guān)性，表明霜凍可能會促進果實總酸向總糖的轉(zhuǎn)變。硒對植物的生理功能有重要作用，參與蛋白質(zhì)的合成，促進植物的生長代謝，增強植物體內(nèi)的抗氧化能力[22]， 植物根系活力隨著硒濃度的上升而增加，植物根系活力和葉綠素含量與硒濃度有關(guān)[23]。本試驗結(jié)果表明，余甘子果實硒含量與SOD 活性、維生素C 含量、總酚含量等主要余甘子果實品質(zhì)指標(biāo)無相關(guān)性，而霜凍后余甘子果實硒含量減少，SOD 活性、維生素C 含量、總酸含量均減少，這些指標(biāo)的變化是否與霜凍后余甘子葉片掉落，光合作用減少，根活力降低有關(guān)，其具體原因有待進一步研究。