真武湯合苓桂術甘湯改善心腎綜合征大鼠模型水鈉潴留的作用機制研究*

高常柏，胡文仲，姜 楠，王寶娟，楊美娟，許 云

（天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

心腎綜合征是一組心腎共同受損的臨床綜合征，即心、腎中某一臟器的功能不全可直接或間接導致另一臟器的損傷，或兩者共同受損[1]。水鈉潴留是心腎綜合征的標志，亦是加重心腎綜合征的關鍵因素，因此消除水鈉潴留是緩解心腎綜合征的重要手段，利尿劑+血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑（ACEI/ARB）是目前臨床治療的常規(guī)用藥[2]，然而已有研究報道利尿劑抵抗可加重腎功能損害以及心力衰竭的再入院風險，增加患者病死率[3]。腎臟是水鈉代謝的重要器官，有研究發(fā)現(xiàn)[4]水通道蛋白2（AQP2）在水鈉潴留時其表達水平升高，可在一定程度上反映機體水鈉潴留狀態(tài)。心腎綜合征腎臟AQP2的過度表達，亦是其水鈉潴留發(fā)生的重要機制之一，若抑制了AQP2的表達，便能減少腎臟對水的重吸收，從而減輕水腫，延緩病情進展。

水鈉潴留與中醫(yī)“水腫”類似，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中即有“水、風水、水脹、水病”的記載，中醫(yī)對水腫的治療方法頗多。近年研究發(fā)現(xiàn)，真武湯和苓桂術甘湯均在緩解水腫、保護心腎功能方面有獨特優(yōu)勢[5]，本實驗旨在探究真武湯合苓桂術甘湯改善心腎綜合征水鈉潴留的作用機制以及對尿AQP2表達的影響，為臨床中醫(yī)治療心腎綜合征提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量140～160 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.1.2 主要藥物 真武湯合苓桂術甘湯藥物組成：白術 30 g，茯苓 15 g，桂枝 10 g，甘草 6 g，附子（先煎）10 g，芍藥10 g，生姜3片，由天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥房提供，使用時配制成每毫升含1.2 g生藥的水溶液，置于4℃冰箱保存，每次配制完成僅使用1周，棄去剩余藥液并重新配置；呋塞米片（20 mg）、貝那普利片（5 mg）、異丙腎上腺素（SIGMA）、戊巴比妥鈉、注射用青霉素鈉[山西省芮城縣紅寶獸藥有限責任公司，獸藥字（2014）040102659]、75%乙醇、0.9%氯化鈉注射液、注射用水、碘伏等。

1.1.3 主要試劑 大鼠尿素氮（BUN）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、大鼠腦鈉肽（BNP）ELISA檢測試劑盒、大鼠血肌酐（Scr）ELISA檢測試劑盒、大鼠AQP2 ELISA檢測試劑盒，均購自武漢純度生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模方法 根據(jù)課題組自制心腎綜合征大鼠造模方法[6]，將60只雄性SD大鼠隨機分為兩組，正常組10只，手術組50只，正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，手術組大鼠在2%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉下，先將左腎2/3切除，1周后再將右腎全切，剔除死亡大鼠。剩余大鼠1周后皮下注射異丙腎上腺素，連續(xù)2 d（間隔24 h，注射量分別為2.5、1.5 mg/kg），注射后常規(guī)飼養(yǎng)1周，剔除死亡大鼠。將剩余存活大鼠按體質(zhì)量分層隨機分為空白組、中藥組、常規(guī)治療組。

1.2.2 給藥方法 造模完成后1周開始灌胃給藥，大鼠具體用藥劑量參照《藥理實驗方法學》[7]中“人與動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算，按照人與大鼠體質(zhì)量70 kg∶200 g的系數(shù)為0.018，中藥按照患者每日服用81 g生藥計算，中藥組大鼠給藥量為7.29 g生藥/（kg·d），常規(guī)治療組給予貝那普利（0.45 mg/kg）+呋塞米（1.8 mg/kg），空白組予等容積的生理鹽水灌胃，3組大鼠灌胃均為每日1次，連續(xù)6周。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 觀察實驗過程中各組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、靈敏度、毛發(fā)情況、食欲、大小便等一般情況及死亡情況。

1.3.2 實驗室指標檢測 大鼠分別在灌胃前、灌胃6周后使用代謝籠留尿1.5 mL，并在當天取大鼠眼底靜脈叢血 1.0～1.5 mL，3 500 r/min 離心 10 min，離心半徑60mm，分離血清，檢測血Scr、BUN以及尿AQP2。全部檢測由武漢純度生物科技有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料使用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 灌胃6周后，空白組、中藥組、常規(guī)治療組大鼠死亡例數(shù)依次為1、2、4只。大鼠死亡前均可觀察到其不喜活動、蜷縮喘息、體質(zhì)量驟降等表現(xiàn)。灌胃6周后，中藥組與常規(guī)治療組大鼠一般情況均較灌胃前改善、喘息不明顯。

2.2 大鼠體質(zhì)量的比較 大鼠造模后，體質(zhì)量增長較空白組明顯緩慢，兩組與空白組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或 P＜0.01），常規(guī)治療組與中藥組大鼠體質(zhì)量之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量的比較（±s）g

表1 大鼠體質(zhì)量的比較（±s）g

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白組n 9造模前 造模后 灌胃6周后173.1±4.8 270.5±30.5 421.6±44.7中藥組 12常規(guī)治療組 9 169.2±6.5 243.7±21.3* 365.3±45.2*171.4±7.4 228.9±26.4** 350.6±48.1**

2.3 各組大鼠灌胃前后觀測指標差值圖 空白組、中藥組及常規(guī)治療組BNP較造模前降低，組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；空白組、中藥組及常規(guī)治療組BUN較造模前升高，組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；空白組、中藥組Scr較造模前降低，常規(guī)治療組較造模前升高，組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；空白組、中藥組及常規(guī)治療組AQP2較造模前升高，組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠灌胃前后觀測指標差值表（±s）

表2 各組大鼠灌胃前后觀測指標差值表（±s）

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3 討論

水通道蛋白是水分子通過細胞膜的輔助蛋白，在維持機體水代謝平衡方面起重要作用，目前已分離出至少13種哺乳動物水通道蛋白[8]，其中AQP2主要分布于腎臟。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，大鼠從尿液排出的AQP2含量與腎組織AQP2含量成正比，且?guī)缀醪皇苣蛄康挠绊?。因此，檢測尿AQP2可間接反映腎臟AQP2表達情況。課題組研究發(fā)現(xiàn)，隨著腎功能惡化，AQP2會持續(xù)性代償表達，增加水的重吸收，加重水鈉潴留狀態(tài)，在腎功能改善后，尿AQP2表達情況與正常大鼠相當，心腎綜合征水鈉潴留狀態(tài)緩解，AQP2可作為心腎綜合征水鈉潴留狀態(tài)的參考指標。

通過3組間AQP2和BNP、Scr的比較，發(fā)現(xiàn)心腎綜合征大鼠尿AQP2的表達主要由腎臟調(diào)控，與BNP水平無關。真武湯合苓桂術甘湯可有效保護心腎功能，延緩心腎綜合征進展，在緩解心腎綜合征水鈉潴留狀態(tài)上有獨特優(yōu)勢。實驗發(fā)現(xiàn)，常規(guī)治療組AQP2呈高表達狀態(tài)，大鼠水鈉潴留狀態(tài)明顯，心腎功能狀態(tài)差，中藥組AQP2表達下降且水腫減輕，說明真武湯合苓桂術甘湯的作用機制可能是抑制了心腎綜合征大鼠腎臟AQP2過度表達，減少水的重吸收，改善水鈉潴留狀態(tài)。腎臟水液代謝紊亂中可有不同程度的AQP2表達改變，心腎綜合征大鼠腎臟AQP2表達變化的發(fā)現(xiàn)，加深了對該病水鈉潴留狀態(tài)以及機體水轉(zhuǎn)運機制的認識，可為中醫(yī)“腎者主水”“腎者水臟，主津液”等理論提供科學數(shù)據(jù)支持。

中醫(yī)古籍中無“心腎綜合征”病名記載，從臨床特點來看，心腎綜合征類似于中醫(yī)“喘證”“心水”“水腫”“關格”等，水飲泛溢乃其核心?！端貑枴酚性啤澳I者主水”“腎者水藏，主津液”，可見其關鍵病位在腎，腎臟衰敗則水失所主，泛溢于皮腠經(jīng)脈臟腑之間。然而心腎相交，腎不獨傷，腎傷則心亦損。《黃帝內(nèi)經(jīng)》有云：“君火以明，相火以位?！本鸺葱模嗷馂槟I，心火下沉以溫腎水，腎水上升以濟心火，可見心腎關系緊密，共榮共損。

心腎綜合征的核心問題是水鈉潴留，臨床主要表現(xiàn)為水腫、尿少、畏寒肢冷、腰膝酸軟、神疲乏力、倚息喘滿、腹脹食少等一派虛寒之象，其責之于腎陽、脾陽、心陽之虛，其中腎為元陽，腎陽為本；脾主運化，則脾陽為用；心主火，故心陽為標，今振腎陽溫脾陽以救心陽，故唯真武湯合苓桂術甘湯用之有效。兩方均是張仲景治水名方，其一出自《金匱要略》，屬于溫脾陽而利水之劑，有如下敘述：“心下有痰飲，胸脅支滿，目眩者，苓桂術甘湯主之?！薄胺蚨虤庥形?，當從小便去之，苓桂術甘湯主之……”另一出自《傷寒論》，屬振腎陽而利水之劑，如：“少陰病，二三日不已……此為有水氣……真武湯主之?！眱煞胶嫌盟幬锕潭?，療效靈驗，今用之治療心腎綜合征的實驗研究依據(jù)充分，并可提供其臨床療效的理論支持，拓展其應用范圍。