2種高通量核酸檢測(cè)方法多種呼吸道病原體檢測(cè)效能比較

荊紅波， 李 湛， 何 牧， 王彥波， 李 文， 馬紅梅

（北京市順義區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，北京 101300）

急性呼吸道感染是一種常見(jiàn)的疾病，感染力強(qiáng)、傳播速度快、發(fā)病率高。不同病原體呼吸道感染的臨床癥狀極為相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆發(fā)時(shí)，及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定致病病原體是臨床診療的關(guān)鍵。近年來(lái)，核酸檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為快速診斷呼吸道病原體的首選方法，且多重病原體檢測(cè)系統(tǒng)也越來(lái)越普及，TaqMan微流體芯片（TaqMan array card，TAC）技術(shù)作為國(guó)內(nèi)外近幾年研究較多的高通量病原體篩查技術(shù)[1-5]，是一種基于384孔微流體卡片中單重定量PCR的微流控技術(shù)。本研究采用多重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和TAC技術(shù)檢測(cè)急性呼吸道感染病原體，比較2種方法的檢測(cè)效能。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

按照北京市“傳染病監(jiān)測(cè)技術(shù)平臺(tái)”發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測(cè)方案病例定義的標(biāo)準(zhǔn)，收集2017年3月—2018年10月北京市順義區(qū)醫(yī)院發(fā)熱門(mén)診、呼吸內(nèi)科門(mén)診、急診、兒科門(mén)診就診的流感樣和肺炎患者臨床樣本419例。樣本類(lèi)型主要為上呼吸道咽拭子樣本、下呼吸道灌洗液和痰液樣本。采集后的臨床樣本立即保存于4 ℃冰箱，24 h內(nèi)送檢，未及時(shí)檢測(cè)樣本于-70℃保存。樣本每月采集，每周均勻分布。

1.2 核酸提取

痰液樣本采用痰消化液（英國(guó)Oxoid公司）消化待用；咽拭子樣本震蕩后直接采用QIAamp viral RNAmini kit（德國(guó)QIAGEN公司）提取病原體核酸，核酸提取后-80℃保存。

1.3 多重?zé)晒舛縋CR核酸檢測(cè)

采用ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）及呼吸道病毒核酸多重聯(lián)檢試劑盒、肺炎支原體和肺炎衣原體核酸多重檢測(cè)試劑盒、腸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒（江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司）檢測(cè)甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、腺病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、冠狀病毒229E型+HKU1型、冠狀病毒NL63型+OC43型、博卡病毒、腸道病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體共18種病原體。

1.4 TAC 檢測(cè)

采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院自主研發(fā)的定制TAC板對(duì)同一例臨床樣本進(jìn)行呼吸道多種病原核酸檢測(cè)，可檢測(cè)的病原體包括甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、甲型流感病毒H5亞型、甲型流感病毒H7亞型、甲型流感病毒N9亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、腺病毒、人偏肺病毒、人偏肺病毒A型、人偏肺病毒B型、鼻病毒、冠狀病毒229E型、冠狀病毒HKU1型、冠狀病毒NL63型、冠狀病毒OC43型、博卡病毒、腸道病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、Q熱立克次氏體、嗜肺軍團(tuán)菌通用型、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、A族鏈球菌、流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌、百日咳鮑特菌（包括Ⅰ相和Ⅱ相）等30余種。

按照AgPath-ID one-step RT-PCR kit（美國(guó)Applied Biosystems公司）說(shuō)明書(shū)要求配置反應(yīng)液體系。每個(gè)樣本取20 μL的核酸提取液加入到80 μL的預(yù)混液中，混合并添加到TAC板上，離心后備用。采用ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：45 ℃ 10 min；95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5 結(jié)果判定

以出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)且循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤38為陽(yáng)性。如果2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，則認(rèn)為該樣本的檢測(cè)結(jié)果是正確的。如果2種方法檢測(cè)結(jié)果不一致，采用單一病原熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行復(fù)核，如果復(fù)核結(jié)果為陽(yáng)性，確認(rèn)復(fù)核結(jié)果并視為最終結(jié)果；如果復(fù)核結(jié)果是陰性，再次使用普通熒光定量PCR復(fù)核，確認(rèn)復(fù)核結(jié)果并視為最終結(jié)果。

1.6 PCR復(fù)核

肺炎支原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腸道病毒、副流感病毒3型采用單一病原熒光定量PCR試劑盒（江蘇碩世生物科技有限公司）進(jìn)行復(fù)核。對(duì)初次復(fù)核結(jié)果不一致的樣本采用普通定量PCR擴(kuò)增測(cè)序復(fù)核，參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)鼻病毒[6]、腸道病毒[7]、副流感病毒3型[6]、甲型流感病毒[8]、乙型流感病毒[9]引物，采用iCycler PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用QIAxcel毛細(xì)管電泳儀（德國(guó)Qiagen公司）進(jìn)行電泳，根據(jù)條帶大小判定結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)結(jié)果

419例樣本中有126例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為30.1%，其中96%（121/126）的陽(yáng)性樣本為單一病原感染，僅有4%（5例）為混合感染，均為2種病原共感染，分別為：肺炎支原體+鼻病毒（1例）、肺炎支原體+乙型流感病毒（1例）、肺炎支原體+腸道病毒（1例）、乙型流感病毒+鼻病毒（1例）、副流感病毒2型+人偏肺病毒（1例）。

2.2 TAC檢測(cè)結(jié)果

419例樣本中有117例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為27.9%。96.6%（113/117）的陽(yáng)性樣本為單一病毒感染，3.4%（4例）為混合感染?；旌细腥局杏?例為2種病毒混合感染，分別為2例鼻病毒+腸道病毒混合感染和1例副流感病毒2型+人偏肺病毒混合感染，1例鼻病毒+腸道病毒+肺炎支原體三重混合感染。除了病毒病原體外，TAC還能檢測(cè)部分細(xì)菌。419例樣本中有55例檢出細(xì)菌，陽(yáng)性率為13.1%，其中74.5%（41/55）為單一細(xì)菌感染，病原體包括19株金黃色葡萄球菌、7株肺炎鏈球菌、9株肺炎克雷伯菌、2株A族鏈球菌、3株百日咳鮑特菌和1株流感嗜血桿菌，有14株（25.5%）為2種以上細(xì)菌混合感染。419例樣本中檢出15例病毒和細(xì)菌的混合感染。

2.3 多重?zé)晒舛縋CR和TAC 檢測(cè)結(jié)果比較

419例樣本中有389例（92.8%）2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，其中陽(yáng)性結(jié)果108例，陰性結(jié)果281例。僅有30例（7.2%）病毒檢測(cè)結(jié)果不一致。

在2種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的30例樣本中，復(fù)核之后的結(jié)果與多重?zé)晒舛縋CR一致18例，其中陽(yáng)性結(jié)果16例、陰性結(jié)果2例；復(fù)核之后的結(jié)果與TAC檢測(cè)結(jié)果一致11例，其中陽(yáng)性結(jié)果9例、陰性結(jié)果2例。見(jiàn)表1。

表1 2種方法不一致結(jié)果的復(fù)核情況

2種方法檢測(cè)肺炎衣原體、1型和2型副流感病毒的敏感性和特異性均為100%。多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)人偏肺病毒的敏感性和特異性均為100%，檢測(cè)其他病毒的特異性均超過(guò)99%、敏感性均超過(guò)80%。TAC檢測(cè)腺病毒的敏感性和特異性均為100%，檢測(cè)其他病毒的特異性均超過(guò)99%，敏感性均為60%～90%。多重?zé)晒舛縋CR和TAC檢測(cè)呼吸道病毒的敏感性分別為93.4%和87.4%，特異性分別為98.9%和98.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為97.7%和97.5%，陰性預(yù)測(cè)值分別為96.9%和94.3%。2種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2、表3。

表2 多重?zé)晒舛縋CR對(duì)單一呼吸道病毒的檢測(cè)性能

表3 TAC對(duì)單一呼吸道病毒的檢測(cè)性能

3 討論

多重?zé)晒舛縋CR是目前比較常用的檢測(cè)呼吸道病毒的方法，而TAC是國(guó)內(nèi)外近幾年研究較多的一種高通量病原體篩查技術(shù)，1次可通過(guò)空間分布實(shí)現(xiàn)對(duì)384個(gè)目標(biāo)的檢測(cè)，被廣泛用于呼吸道病毒、腸道細(xì)菌、瘧疾和基因表達(dá)等研究中[2-5]。KODANI等[10]發(fā)現(xiàn)，TAC檢測(cè)在呼吸道病原體的敏感性和特異性接近于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)單一病原體的敏感性和特異性。STEENSELS等[11]發(fā)現(xiàn)，TAC技術(shù)呼吸道病毒的檢出率明顯高于常規(guī)的直接熒光抗體呼吸道病毒檢測(cè)法。

本研究結(jié)果表明，2種方法檢測(cè)單一病毒的特異性均接近100%，但TAC技術(shù)的檢測(cè)敏感性，尤其是檢測(cè)副流感病毒3型、乙型流感病毒、鼻病毒和腸道病毒的敏感性低于熒光定量PCR。可能由于TAC技術(shù)對(duì)所有的反應(yīng)均采用同一個(gè)提取方法、PCR體系和反應(yīng)條件導(dǎo)致的。而多重PCR可以根據(jù)不同病原體優(yōu)化不同的實(shí)驗(yàn)條件，可能會(huì)更敏感地檢測(cè)到某些病原體。

在不明原因的呼吸道感染中，細(xì)菌和病毒共感染會(huì)使病情更為復(fù)雜，迫切需要快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出致病病原體，TAC技術(shù)病原譜檢測(cè)范圍更為廣泛，能同時(shí)對(duì)38種病原體進(jìn)行檢測(cè)，包括27種病毒、8種細(xì)菌和3種其他非經(jīng)典微生物。TAC主要基于384孔板上的單重?zé)晒舛縋CR，相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)條件，每個(gè)孔的反應(yīng)體積僅需要3 μL左右。多重?zé)晒舛縋CR可對(duì)16種病毒和2種其他病原體進(jìn)行檢測(cè)。此方法主要是基于單管多重?cái)U(kuò)增，將幾種不同病原體的引物集中在同一個(gè)管中進(jìn)行檢測(cè)。本研究使用3種試劑盒，如檢測(cè)TAC涵蓋的其他病原體，則需要更多的試劑盒。因此相對(duì)來(lái)說(shuō)，TAC檢測(cè)的病原體種類(lèi)更多一些，這在疾病監(jiān)測(cè)，特別是暴發(fā)疫情的調(diào)查中，可以在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)多個(gè)患者樣本中38種病原體的檢測(cè)，尤其可以快速檢測(cè)到多種呼吸道病原體共感染的情況。而使用多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行如此多的病原體檢測(cè)，需要花費(fèi)更多的時(shí)間，也增加了檢測(cè)成本。因此，當(dāng)呼吸道疾病的病因未知或懷疑多種病原體共同感染時(shí)，TAC技術(shù)是實(shí)現(xiàn)快速篩查的有效方法。

本研究對(duì)2種方法的操作簡(jiǎn)便性和時(shí)效性進(jìn)行了比較，2種方法樣本處理及核酸提取的過(guò)程相同，結(jié)果判讀都是依據(jù)Ct值。TAC技術(shù)1次能同時(shí)檢測(cè)38種病原體，但每次只能檢測(cè)8個(gè)樣本；多重?zé)晒舛縋CR 1次能同時(shí)檢測(cè)18種病原體，但每次最多檢測(cè)18個(gè)樣本。操作步驟方面，TAC技術(shù)操作簡(jiǎn)便，僅需一步操作即可完成；而多重?zé)晒舛縋CR需要配置多個(gè)試劑盒，需要手工操作的步驟比較多。儀器要求方面，TAC技術(shù)完成所有病原體的檢測(cè)僅需要1臺(tái)熒光定量PCR儀，1.5～2 h即可完成，但如果同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體需要的時(shí)間也會(huì)相應(yīng)增加；多重?zé)晒舛縋CR需要2臺(tái)熒光定量PCR儀，2.5～3 h完成，如果需要進(jìn)行更多的病原體檢測(cè)，也需要更多的時(shí)間或更多的儀器。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)際情況來(lái)選擇合適的方法。

本研究因未找到相應(yīng)的呼吸道細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，僅比較了2種方法在多種呼吸道病毒和2種其他病原體檢測(cè)方面的性能，沒(méi)有比較呼吸道細(xì)菌檢測(cè)的性能，具有一定的局限性。本研究結(jié)果顯示，TAC技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的檢出率較高，與國(guó)外報(bào)道[6]相似。雖然尚不清楚是否與疾病相關(guān)，但國(guó)外有報(bào)道肺炎鏈球菌在病例組和正常對(duì)照組中都能被檢測(cè)到，且檢出率相近，是否是引起疾病的原因尚待進(jìn)一步分析[12]。本研究檢出3例百日咳鮑特菌感染病例，且得到了臨床的證實(shí)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)控制了病情。

綜上所述，TAC技術(shù)與多重?zé)晒舛縋CR常見(jiàn)呼吸道病毒檢測(cè)的敏感性和特異性相近，但TAC技術(shù)病原譜的檢測(cè)范圍更廣，在緊急情況下可作為快速篩查多種呼吸道病原體的有效方法。