CD55、CD59聯(lián)合嗜水氣單胞菌毒素變異體檢測(cè)對(duì)PNH的診斷價(jià)值

魯家才， 黃 瑩， 莫 揚(yáng)， 周小芬， 姚 欣

（襄陽市中心醫(yī)院 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

CD55、CD59屬于糖化肌醇磷脂（glycosylphatidylinositol，GPI）錨鏈膜蛋白，普遍存在于血細(xì)胞膜上。PIG-A基因突變可導(dǎo)致GPI錨鏈膜蛋白合成障礙，引起補(bǔ)體活化和細(xì)胞溶解。CD55、CD59缺陷是陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的主要臨床特征，部分干細(xì)胞疾病和淋巴增殖性疾病均可檢出PNH克隆[1-2]。嗜水氣單胞菌毒素變異體（fluorescent aerolysin，F(xiàn)LAER）能與細(xì)胞膜上的GPI錨鏈膜蛋白結(jié)合，聚合成多聚體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì)中，形成孔洞，使細(xì)胞滲透壓改變，從而被溶解。然而，血型糖蛋白與嗜水氣單胞菌毒素結(jié)合力較弱，限制了FLAER對(duì)紅細(xì)胞的檢測(cè)能力[3]。本研究旨在探討CD55、CD59聯(lián)合FLAER檢測(cè)對(duì)PNH的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年3月—2017年7月襄陽市中心醫(yī)院血液科貧血住院患者157例，其中男87例、女70例，年齡（48.1±19.3）歲。根據(jù)貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，將其分為缺鐵性貧血（iron deficiency a n e m i a，I D A）3 8例、巨幼細(xì)胞性貧血（megaloblastic anemia，MA）23例、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）27例、再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）25例、自身免疫溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）31例、PNH 13例。另選取襄陽市中心醫(yī)院體檢健康者20名，作為正常對(duì)照組，其中男10名、女10名，年齡（48.9±14.5）歲，均無貧血史。

1.2 儀器與試劑

FC500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；CD59-FITC、CD55-PE、CD45-PerCP、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)BD公司；CD15-PE、CD14-APC、FLAER-FITC和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 方法

采集所有研究對(duì)象2.0 mL外周血，并進(jìn)行乙二胺四乙酸二鉀抗凝處理。

1.3.1 紅細(xì)胞標(biāo)記及檢測(cè) 取5 μL抗凝全血，加入含100 μL PBS的流式專用試管中，輕輕混勻，分別加入20 μL CD59和20 μL CD55，混勻，避光孵育15 min后，加入1 mL PBS，待檢。在FSCSCC散點(diǎn)圖上選定紅細(xì)胞群，設(shè)門、圈出欲分析的細(xì)胞群，計(jì)算紅細(xì)胞CD55和CD59表達(dá)水平。

1.3.2 粒細(xì)胞標(biāo)記及檢測(cè) 取100 μL抗凝全血，加入流式專用試管中，加溶血素1 mL，充分混勻，避光孵育10 min后，300×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS，300×g離心5 min，棄上清液，分別加入20 μL CD59和20 μL CD55，混勻，避光10 min后，加入0.3 mL PBS，待檢。在FSCSCC散點(diǎn)圖上選定粒細(xì)胞群，設(shè)門、圈出欲分析的細(xì)胞群，計(jì)算粒細(xì)胞CD55和CD59表達(dá)水平。

1.3.3 粒細(xì)胞、單核細(xì)胞FLAER檢測(cè) 取100 μL抗凝全血，加入CD45、CD14、CD15、FLAER抗體各10 μL，避光孵育30 min后，加溶血素2 mL，室溫下避光10 min，溶血完全后300 ×g離心5 min，棄上清液，用2 mL PBS洗滌2遍，重新懸于500 μL的PBS中，上機(jī)檢測(cè)。分析8 000個(gè)有核細(xì)胞，以SCC/CD45設(shè)門，分別圈出粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。以FLAER-/CD15細(xì)胞百分比為粒細(xì)胞PNH克隆數(shù)，以FLAER-/CD14細(xì)胞百分比為單核細(xì)胞PNH克隆數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

由于外周血CD55-、CD59-離散程度較大，故數(shù)據(jù)資料采用CD55-、CD59-百分比表示。將CD55-、CD59-百分比＞10%視為對(duì)PNH有診斷價(jià)值；另將FLAER-百分比＞0.5%視為存在PNH克隆，對(duì)PNH有診斷價(jià)值[5]。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55、CD59檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比均＜5%，PNH組紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，PNH組與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。PNH組CD55、CD59、FLAER陰性患者（陰性細(xì)胞過高患者）粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比分別高于紅細(xì)胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），見表2。

表1 各組CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

表1 各組CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 紅細(xì)胞CD55-紅細(xì)胞CD59-粒細(xì)胞CD55- 粒細(xì)胞CD59- 粒細(xì)胞FLAER- 單核細(xì)胞FLAERIDA組 38 3.61±1.63 2.22±1.97 2.24±1.47 2.71±2.80 0.02±0.03 0.03±0.02 MA組 23 3.32±1.31 2.46±1.89 2.35±1.77 2.51±0.90 0.03±0.02 0.03±0.02 MDS組 27 4.41±3.63 3.55±4.57 6.53±11.31 3.65±3.76 2.13±7.11 0.73±1.31 AA組 25 5.41±8.33 4.64±3.45 5.90±8.65 6.19±7.34 6.54±5.20 6.51±4.16 AIHA組 31 5.53±4.12 4.07±5.41 1.65±1.31 2.17±1.35 0.05±0.04 0.03±0.02 PNH組 13 27.52±15.50* 28.65±14.55* 45.10±15.20* 47.30±14.20* 75.10±20.30# 71.32±15.20#正常對(duì)照組 20 3.63±2.24 1.43±1.94 2.07±1.47 2.78±2.27 0.02±0.02 0.17±0.12

表2 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

表2 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

注：與紅細(xì)胞CD55-比較，*P＜0.05；與紅細(xì)胞CD59-比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 紅細(xì)胞CD55- 紅細(xì)胞CD59- 粒細(xì)胞CD55- 粒細(xì)胞CD59-MDS組 2 6.73±4.34 2.41±4.89 6.82±7.34 4.60±4.28 AA組 4 9.77±5.57 5.75±3.44 10.86±7.65 12.73±5.57 AIHA組 2 12.36±6.72 9.12±8.15 1.67±1.28 2.16±1.57 PNH組 13 27.52±15.50 28.65±14.55 45.1±15.20* 47.30±14.20#

2例MDS患者和4例AA患者CD55-、CD59-表達(dá)為陽性，但紅細(xì)胞、粒細(xì)胞表達(dá)沒有一致性。2例AIHA患者紅細(xì)胞CD55-、CD59-表達(dá)增多，但粒細(xì)胞表達(dá)正常。IDA和MA患者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-表達(dá)均正常。

2.2 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞FLAER檢測(cè)結(jié)果

PNH組粒細(xì)胞和單核細(xì)胞FLAER-百分比均＞50%，顯著高于紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05）。7例AA患者FLAER-百分比顯著高于4例MDS患者（P＜0.05），見表3。IDA和MA患者粒細(xì)胞和單核細(xì)胞FLAER-表達(dá)均正常。

表3 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者FLAER-百分比 %，±s

表3 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者FLAER-百分比 %，±s

注：與MDS組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 粒細(xì)胞FLAER-單核細(xì)胞FLAERMDS組 4 2.67±0.87 2.54±0.85 AA組 7 6.70±4.16* 6.31±4.03*PNH組 13 75.10±20.30 71.32±15.20

2.3 CD55、CD59與FLAER檢測(cè)結(jié)果比較

CD55、CD59與FLAER診斷PNH的符合率為100%。有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表達(dá)缺失，而CD55、CD59表達(dá)正常；有2例AIHA患者紅細(xì)胞CD55、CD59表達(dá)部分缺失，粒細(xì)胞CD55、CD59表達(dá)正常，F(xiàn)LAER表達(dá)正常。

3 討論

PNH是一種造血干細(xì)胞克隆缺陷性疾病，因X染色體上PIG-A基因發(fā)生突變，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜GPI錨鏈膜蛋白缺陷，CD55、CD59等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白合成減少，細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體敏感性增強(qiáng)，最終引起血管內(nèi)溶血[6]。PIG-A基因突變?cè)谠S多疾病中可見，如AA、MDS、漿細(xì)胞病、淋巴增殖性疾病[1-2]。本研究結(jié)果顯示，PNH組紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，CD55、CD59、FLAER陰性患者粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比顯著高于紅細(xì)胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），這可能是PNH患者溶血或輸血導(dǎo)致紅細(xì)胞膜PNH克隆數(shù)減少所致。PNH組粒細(xì)胞和單核細(xì)胞FLAER-百分比均＞50%，顯著高于紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），說明FLAER檢測(cè)對(duì)PNH克隆檢測(cè)更敏感。錨鏈膜蛋白缺失程度與PNH患者病情有關(guān)[7-8]。

31例AIHA患者中有2例紅細(xì)胞CD55-、CD59-表達(dá)增多，但粒細(xì)胞表達(dá)正常，這可能是AIHA患者紅細(xì)胞GPI錨鏈膜蛋白輕度受損或被覆蓋所致，其FLAER表達(dá)未見異常，提示AIHA患者GPI合成沒有缺陷。本研究有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表達(dá)缺失，而CD55、CD59表達(dá)正常，提示FLAER檢測(cè)相對(duì)于CD55、CD59檢測(cè)來說更敏感，更利于較小PNH克隆的檢測(cè)。

本研究27例MDS患者中有4例伴PNH克隆，這可能是造血干細(xì)胞基因錯(cuò)義突變引起GPI合成缺陷所致，這些隨機(jī)產(chǎn)生的小克隆干細(xì)胞并沒有獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，表達(dá)不明顯，多為一過性出現(xiàn)，故MDS伴PNH患者的總體生存情況一般不受影響[9]。本研究25例AA患者中有7例伴PNH克隆，PNH克隆的發(fā)生與AA關(guān)系密切，少數(shù)病例在某些條件下可互相轉(zhuǎn)化或伴生，即先表現(xiàn)AA后出現(xiàn)PNH克隆，繼而轉(zhuǎn)為AA-PNH綜合征，PNH克隆可增多、減少或缺失[9-10]。AA患者PNH克隆的出現(xiàn)可能有助于患者血液學(xué)指標(biāo)的恢復(fù)，AA-PNH綜合征患者無論是血液學(xué)反應(yīng)率還是無病生存率均優(yōu)于PNH克隆陰性者[11]，故明確AA和PNH的關(guān)系可能會(huì)有助于早期識(shí)別和診斷AA，然而PAH與AA治療反應(yīng)之間可能無相關(guān)性[12]。

部分PNH患者因全血減少不易與AA、MDS伴有PNH克隆患者進(jìn)行鑒別診斷，故CD55、CD59聯(lián)合FLAER檢測(cè)在PNH診斷及鑒別診斷中有重要價(jià)值。FLAER檢測(cè)能夠監(jiān)測(cè)PNH患者或AA、MDS存在小克隆患者的免疫抑制治療情況，對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸和療效觀察有著重要的作用。