長鏈非編碼RNA EPIC1 在肝細胞肝癌中的表達及臨床意義*

羅 茜，薛 紅，卞兆連*

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院1 肝病研究所，2 重癥感染科，南通 226006)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是源自肝臟的惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率均居于惡性腫瘤的前列。我國的HCC 發(fā)病率較高，江蘇南通等東南沿海一帶更是我國HCC 的高發(fā)區(qū)之一[1]。目前HCC的病因和發(fā)病機制仍不明確，一般認為HCC 的發(fā)生是病毒感染、遺傳等多因素長期作用的結果[2]，深入探討HCC 的發(fā)病機制顯得尤為重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度＞200 nt，不具備蛋白質編碼功能的RNA分子。過去lncRNAs 被誤認為是“轉錄噪音”而未受到重視[3]。近來研究[4]表明，lncRNAs 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移、腫瘤血管生成等惡性生物學進程。在HCC 的發(fā)生發(fā)展過程中，通常伴lncRNAs 的表達失調，異常表達的lncRNAs 會導致腫瘤不可控制地生長甚至轉移[5-6]。Z.H.WANG 等[7]通過遺傳學圖譜發(fā)現并確定了表觀遺傳誘發(fā)lncRNA1(epigenetically induced lncRNA1,EPIC1)在乳腺癌中表達顯著升高，且與患者的不良預后相關。本研究對EPIC1 在HCC 中的表達和潛在功能進行檢測。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2013年9月—2018年3月在南通市第三人民醫(yī)院肝膽外科確診為HCC 并手術切除的48 例患者的配對組織，所有患者均簽署知情同意書，并經南通市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準，其中男36 例，女12 例，平均年齡(58.38±11.22)歲。所有組織標本離體0.5 h 內浸泡于RNAlater 中，過夜后轉移至-80 ℃冰箱存放。收集患者的臨床病理及術前末次血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)等資料。

1.2 細胞培養(yǎng) 從中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫購買人源肝癌細胞HuH-7、Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、Li-7 和SK-HEP-1 以及正常肝臟上皮細胞系L-02。Li-7、L-02 細胞培養(yǎng)條件為RPMI-1640 培養(yǎng)基：90%，FBS：10%。HuH-7 細胞培養(yǎng)條件為高糖DMEM 培養(yǎng)基：90%，FBS：10%。Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1 細胞培養(yǎng)條件為MEM 培養(yǎng)基：90%，FBS：10%。所有細胞均置于37 ℃、含5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每24 h 更換1 次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到90%時開始傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑 RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(RR820A)均購自北京Takara 公司。

1.4 總RNA 的提取 取新鮮組織樣本，加入1 mL RNAiso Plus 于冰上勻漿，室溫靜置后12 000 g 4 ℃離心5 min，在上清液中加入200 μL 氯仿，上下顛倒使之乳化，12 000 g 4 ℃離心15 min，吸取上清液，向其中加入1 mL 異丙醇沉淀RNA，12 000 g 4 ℃離心30 min，再加入1 mL 75%乙醇進行洗滌，7 500 g 4 ℃離心5 min 后棄乙醇，讓沉淀RNA 在室溫干燥后加入DEPC 水溶解，于NanoDrop-One 檢測RNA的純度及濃度。

1.5 逆轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR) 取1 μg RNA 逆轉錄生成cDNA，在冰上配制反應體系。輕柔混勻后進行逆轉錄反應，條件如下：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃∞。采用qRT-PCR 檢測EPIC1 的相對表達水平。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。結果分析采用經典的2-△△ct法進行基因表達的相對定量。EPIC1 上游引物：5′-TACAAGCCAGGAACTGAACC-3′；下游引物：5′-ATAACAAAGCTCCACCGC-3′。內參β-actin 上游引物：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′；下游引物：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。

1.6 統計學方法 本研究采用IBM SPSS Statistics 24 及GraphPad prism 8.0 進行統計分析。對于符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示。使用配對t 檢驗分析HCC 癌灶及鄰近正常組織之間的表達差異，使用χ2檢驗分析EPIC1 與臨床病理學參數的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 lncRNA EPIC1 在HCC組織中低表達 通過qRT-PCR 檢測HCC 和癌旁組織中EPIC1 的表達情況，結果顯示EPIC1 在HCC 和癌旁組織的表達分別為(13.28±36.66)和(62.84±108.93)，肝癌組織中EPIC1低于癌旁組織(P=0.006)(圖1)。

2.2 lncRNA EPIC1 在肝癌細胞中低表達 qRTPCR 結果顯示，相較于正常肝臟上皮細胞L-02，肝癌細胞中EPIC1 在5 種肝癌細胞系HuH-7(P=0.013)、Hep 3B2.1-7(P=0.001)、PLC/PRF/5(P=0.004)、Li-7(P=0.001)、SK-HEP-1(P=0.004)中的表達均明顯下降(圖2)。

2.3 EPIC1 的表達與HCC 患者病理分期相關 進一步分析EPIC1 表達與患者性別、年齡、術前末次AFP 水平、TNM 分期、腫塊直徑、微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)等臨床因素的關系。結果發(fā)現，EPIC1 表達量與患者性別(P=0.505)、年齡(P=0.858)、術前末次AFP 水平(P=0.966)、腫塊直徑(P=0.551)和MVI(P=0.233)均無相關，但與TNM 分期顯著相關(P=0.033)(表1)。

表1 EPIC1 表達與患者臨床參數的相關性

3 討 論

我國作為一個“肝病大國”，每年新增的HCC 病例數占全球的一半以上，HCC 的防治工作尤為嚴峻。同時，因為HCC 發(fā)病隱匿，患者多在體檢或肝病隨訪時B 超檢查發(fā)現，加之現有的AFP、異常凝血酶原等血清學標志物缺乏足夠的靈敏度和特異性，給臨床上HCC 的早發(fā)現、早診斷帶來難度。

起初認為lncRNAs 是不具備生物學功能的無用片段，隨著基因芯片和二代測序技術的發(fā)展，lncRNAs 被發(fā)現可在染色質構象、轉錄水平和轉錄后水平等多個層面參與對下游分子或信號通路的調控，進而廣泛影響生理病理過程[8]。lncRNA 常見的作用模式有：(1)作為順、反式作用元件，調控基因轉錄；(2)通過特定的元件結合蛋白質分子，影響蛋白的分子活性和細胞內定位；(3)結合胞漿中的mRNA 前體或成熟體并在轉錄后水平對mRNA 進行修飾；(4)充當miRNA 海綿，競爭性結合miRNA，解除miRNA 對下游靶基因的抑制作用，從而調節(jié)下游靶基因的表達[9-11]。

大量的實驗證據[11-12]表明在人體多種惡性腫瘤組織中l(wèi)ncRNAs 的表達譜發(fā)生了顯著的差異表達，lncRNAs 可參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移等生物學過程。HOTAIR 被證實在乳腺癌中高表達，通過結合并調節(jié)PRC2 復合物，對組蛋白甲基化修飾調控相關基因的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲、轉移，同時HOTAIR 也是影響乳腺癌患者預后的獨立危險因素。R.Q.JIANG 等[13]通過大規(guī)模臨床樣本發(fā)現lnc-EGFR 與肝癌患者Treg 及CTL 亞群分布關聯，體內外實驗表明lnc-EGFR 靶向EGFR/NFAT1 介導Treg/CTL 異常分布促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。

Z.H.WANG 等[7]研究表明，EPIC1 能在一定程度上增強MYC-MAX 兩者之間的相互作用。EPIC1 可能是通過調節(jié)MYC 上MYC-MAX 特異性的結合位點來影響MYC 的“占有率”，但對其他非特異性的結合并無明顯影響。本研究發(fā)現lncRNA EPIC1 在HCC組織、細胞中呈低表達，進一步分析患者的性別、年齡、術前末次AFP 含量、腫塊直徑等臨床參數，我們發(fā)現EPIC1 的表達與患者的TNM 分期密切相關，但和患者的性別、年齡、AFP 含量、腫塊直徑、MVI 均不存在顯著的相關性。提示EPIC1 參與了HCC 的發(fā)生發(fā)展，但其具體的作用機制及調控機制尚不明確。深入探討EPIC1 在HCC 的具體作用機制，有利于推進臨床闡明HCC 的發(fā)病機制，為疾病的預防和靶向治療等提供新的思路。