PTEN與CyclinG1蛋白在嬰幼兒血管瘤組織中的表達(dá)及意義

余咸靜 鄭騰飛

[摘要]目的：探究血管瘤組織第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）與細(xì)胞周期素G1（Cyclin G1）的表達(dá)。方法：回顧性分析142例血管瘤患兒臨床資料，比較血管瘤瘤體組織與瘤旁組織、增殖期與消退期血管瘤組織、術(shù)后6個月內(nèi)復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)血管瘤組織PTEN、Cyclin G1蛋白表達(dá)情況，以受試者工作特征（ROC）曲線評估上述指標(biāo)對血管瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測效能，通過Pearson相關(guān)系數(shù)模型分析上述指標(biāo)與血管瘤表面積、深度、微血管密度（MVD）的相關(guān)性。結(jié)果：PTEN蛋白表達(dá)情況比較顯示，血管瘤瘤體組織明顯低于瘤旁組織，增殖期血管瘤組織明顯低于消退期血管瘤組織，預(yù)后復(fù)發(fā)血管瘤組織明顯低于預(yù)后未復(fù)發(fā)血管瘤組織（P<0.05）;Cyclin G1蛋白表達(dá)情況比較顯示，血管瘤瘤體組織明顯高于瘤旁組織，增殖期血管瘤組織明顯高于消退期血管瘤組織，預(yù)后復(fù)發(fā)血管瘤組織明顯高于預(yù)后未復(fù)發(fā)血管瘤組織（P<0.05）。且PTEN、Cyclin G1蛋白表達(dá)水平聯(lián)合預(yù)測復(fù)發(fā)的靈敏度與特異度可達(dá)64.10%、78.64%。血管瘤組織PTEN蛋白表達(dá)與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著負(fù)相關(guān)性（r<0，P<0.05），Cyclin G1蛋白表達(dá)與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著正相關(guān)性（r>0，P<0.05）。結(jié)論：血管瘤組織存在PTEN蛋白低表達(dá)與Cyclin G1蛋白過表達(dá)情況，且表達(dá)水平與病情、預(yù)后均聯(lián)系緊密，可為疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究及臨床預(yù)后評估提供指導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞]第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物;細(xì)胞周期素G1;血管瘤組織;蛋白表達(dá);相關(guān)性

Abstract： Objective? To explore the significance of phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten （PTEN） and cyclin G1 （Cyclin G1） in hemangioma tissues. Methods? The clinical data of 142 children patients with hemangiomas were retrospectively analyzed. The protein expressions of PTEN and Cyclin G1 were compared between hemangioma tissues and para-tumor tissues， between proliferative and regressive hemangioma tissues and between recurrent and non-recurrent hemangiomas within 6 months after surgery. The receiver operating characteristic （ROC） curve was used to evaluate the predictive efficacy of the above indexes on recurrence of hemangiomas. The correlation between the above indexes and the surface area， depth and microvessel density （MVD） of hemangiomas was analyzed by Pearson correlation coefficient model. Results? The expression of PTEN protein in hemangioma tissues was significantly lower than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly lower than that in regressive hemangioma tissues， and the expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly lower than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The expression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues was significantly higher than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly higher than that in regressive hemangioma tissues， and the? expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly higher than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The sensitivity and specificity of combined detection of PTEN and Cyclin G1 proteins were 64.10% and 78.64% in predicting recurrence. The PTEN protein expression in hemangioma tissues was significantly negatively correlated with surface area， depth and MVD of lesions （r<0， P<0.05）， and the Cyclin G1 protein expression was significantly positively correlated with surface area， depth and MVD of lesions （r>0， P<0.05）. Conclusion? There is a low expression of PTEN protein and overexpression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues， and the expression levels are closely related to the disease condition and prognosis. They can provide guidance for the mechanism study of disease occurrence and development and the evaluation of clinical prognosis.

Key words： phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten（PTEN）; Cyclin G1; hemangioma tissues; protein expression; correlation

血管瘤是內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞異常增殖引起的常見良性腫瘤，嬰幼兒較為常見，發(fā)病率可達(dá)4%～5%[1]，由于病灶位置淺表，可觀察到紅色丘疹、結(jié)節(jié)或斑塊等癥狀，嚴(yán)重影響患兒外觀，不利于其心身健康發(fā)育[2]。血管瘤具體發(fā)病機(jī)制目前尚未獲得共識，可能與女性、早產(chǎn)、低出生體重、多胎妊娠、高齡產(chǎn)婦及父母毒性物質(zhì)接觸等因素有關(guān)[3]，盡管部分患兒能在數(shù)月后自行消退，但臨床仍推薦開展早期治療，以確保良好療效與外觀恢復(fù)[4]。近年來，腫瘤生物學(xué)行為分析已成為研究熱點，第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）屬于典型的抑癌基因表達(dá)蛋白，已證實能抑制肝癌細(xì)胞增殖[5];細(xì)胞周期素G1（Cyclin G1）則是典型的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，能提高肝癌細(xì)胞放射線敏感度[6]。猜測血管瘤細(xì)胞編碼PTEN也可能具有阻礙腫瘤浸潤作用，對細(xì)胞周期異常激進(jìn)狀態(tài)可造成一定負(fù)面影響，導(dǎo)致Cyclin G1表達(dá)受到反饋抑制，猜想兩者聯(lián)合檢測可對血管瘤生物學(xué)行為進(jìn)行早期評估，從而對患兒病情作出及早判斷，可為臨床診療與病理基礎(chǔ)研究提供一定參考。基于此，本研究旨在分析血管瘤組織表達(dá)PTEN、Cyclin G1蛋白與其疾病特征的關(guān)系，取得一定成果，現(xiàn)作如下報道。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：回顧性分析2017年1月-2018年12月，于筆者醫(yī)院接受治療的142例血管瘤患兒臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)與組織學(xué)病理檢查結(jié)果均符合血管瘤相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②月齡≤24個月;③家長同意采集標(biāo)本用作研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前已接受任何抗腫瘤措施;②身體條件無法耐受手術(shù);③術(shù)中未能獲得完整腫瘤病理組織與瘤旁組織。其中男32例，女110例;月齡為1～24個月，平均（11.57±8.26）個月;病灶位于頜面部74例，肩頸部29例，胸背部20例，腹部7例，四肢12例;病灶表面積為（11.83±3.64）cm2;病灶深度為（10.51±3.07）mm;病程為（9.74±3.25）個月;增殖期腫瘤79例，消退期腫瘤63例;術(shù)后隨訪6個月內(nèi)復(fù)發(fā)39例（術(shù)后6個月內(nèi)瘤體增大≥20%，或顏色加深程度≥20%可確診為血管瘤復(fù)發(fā)），未復(fù)發(fā)103例。

1.2 檢測方法：組織采集后置于4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4μm，72℃烘箱烤片1h，依次浸入二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇5～15min不等，進(jìn)行脫蠟與水化處理;蒸餾水浸泡5min×3次，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5min×1次，以pH=6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高壓鍋內(nèi)處理3min，自然冷卻2h至室溫;PBS浸泡5min×3次，滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加羊血清工作液封閉，37℃下孵育30 min;傾去血清不予洗滌，分別向不同標(biāo)本加入兔抗人PTEN單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology有限公司提供）、兔抗人Cyclin G1單克隆抗體（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司提供），向空白對照標(biāo)本滴加等體積PBS，4℃下孵育過夜;PBS浸泡5min×3次，滴加生物素化二抗，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，低倍鏡下觀察組織顯色情況后迅速以自來水沖洗5min終止反應(yīng);滴加蘇木素染色液進(jìn)行核染色1min，1%鹽酸酒精分化液處理5s×3次，自來水沖洗5min反藍(lán);依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇1～5min不等，進(jìn)行脫水處理，并以中性樹膠固封，晾干并置于高倍鏡下觀察;隨機(jī)選取5個視野，圖像采集后拷貝至Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件，分別測算PTEN、Cyclin G1蛋白陽性產(chǎn)物積分光密度（IOD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：研究數(shù)據(jù)均錄入統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行處理，計數(shù)資料以例數(shù)表示，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同組織之間比較采用配對t檢驗;將各指標(biāo)同時納入二元Logistic回歸模型作為協(xié)變量，采用前進(jìn)法，以返回概率作為聯(lián)合預(yù)測指標(biāo);預(yù)后預(yù)測效能評估采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（95%CI）、靈敏度、特異度、截斷值等統(tǒng)計參數(shù);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)模型，雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 瘤體組織與瘤旁組織蛋白表達(dá)情況比較：瘤體組織PTEN蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯低于瘤旁組織，Cyclin G1蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯高于瘤旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1、圖1～2。

2.2 增殖期與消退期血管瘤組織蛋白表達(dá)情況比較：增殖期血管瘤組織PTEN蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯低于消退期血管瘤組織，Cyclin G1蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯高于消退期血管瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 預(yù)后復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)血管瘤組織蛋白表達(dá)情況比較：術(shù)后6個月內(nèi)，預(yù)后復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織PTEN蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯低于未復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織，Cyclin G1蛋白陽性產(chǎn)物IOD值明顯高于預(yù)后未復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 預(yù)測效能評估結(jié)果：瘤體組織PTEN、Cyclin G1蛋白陽性產(chǎn)物IOD值預(yù)測血管瘤復(fù)發(fā)的截斷值分別為0.3816、0.3005，聯(lián)合預(yù)測靈敏度與特異度為64.10%、78.64%，見圖3、表4。

2.5 相關(guān)性分析結(jié)果：Pearson相關(guān)系數(shù)模型顯示，血管瘤組織PTEN蛋白表達(dá)與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著負(fù)相關(guān)性（r<0，P<0.05），Cyclin G1蛋白表達(dá)與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著正相關(guān)性（r>0，P<0.05），見表5。

3? 討論

PTEN基因定位于人10號染色體q23上，含有9個外顯子與8個內(nèi)含子，可編碼出PTEN含有403個氨基酸，分子量為47kDa，蛋白N端有磷脂酰肌醇特異性結(jié)合域，是調(diào)控磷酸化酶的關(guān)鍵序列[8]。與其他抑癌基因蛋白不同，PTEN同時對脂質(zhì)磷酸酶與蛋白磷酸酶具有雙重活性，對磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K-Akt/PKB）通路可產(chǎn)生較強(qiáng)拮抗作用，促使細(xì)胞周期停止在G1期，并令蛋白激酶從胞質(zhì)向胞膜上轉(zhuǎn)移，改變構(gòu)象并向核內(nèi)傳遞凋亡信號，導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯并走向凋亡[9-10]。本研究結(jié)果顯示，血管瘤組織PTEN蛋白表達(dá)顯著較瘤旁組織更低，增殖期血管瘤組織PTEN蛋白表達(dá)顯著較消退期血管瘤組織更低，預(yù)后復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織PTEN蛋白表達(dá)顯著較預(yù)后未復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織更低，且該指標(biāo)與血管瘤表面積、深度、MVD均表現(xiàn)出明顯負(fù)相關(guān)性，這表明血管瘤組織與其他腫瘤相似，PTEN呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，增殖期瘤體內(nèi)表達(dá)尤其活躍，可反映在病灶表面積、深度與MVD等浸潤性指標(biāo)上，表達(dá)水平越低，浸潤行為越明顯，手術(shù)有更大風(fēng)險遺留微小癌灶，預(yù)后則有更大幾率復(fù)發(fā)，因此可預(yù)測患兒預(yù)后情況，具有較高臨床檢測價值。相關(guān)專家表示，PTEN還能抑制腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-絲裂原活化蛋白激酶（ERK-MAPK）上游途徑接頭蛋白的磷酸化過程，進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)，阻礙有絲分裂信號傳遞，并降低黏附斑激酶（FAK）的整合素活性，上調(diào)細(xì)胞黏附能力，抑制細(xì)胞骨架形成并阻礙其擴(kuò)散，對腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移有較強(qiáng)攔截作用[11]。

Cyclin G最初發(fā)現(xiàn)于小鼠成纖維細(xì)胞中，含有Cyclin G1、Cyclin G2、Cyclin G3三種亞型，其中Cyclin G1基因定位于5號染色體q32-q34上，含有6個外顯子[12]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，泛素蛋白連接酶、Cyclin G1均是抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄激活靶點，可將細(xì)胞周期鎖定在G前期與G-S期，但由于反饋作用機(jī)制，野生型p53表達(dá)代償性上調(diào)的同時，泛素蛋白連接酶與Cyclin G1表達(dá)水平隨之增加，前者在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合p53使其失活后失去生理病理效應(yīng)，而Cyclin G1則呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達(dá)顯著較瘤旁組織更高，增殖期血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達(dá)顯著較消退期更高，預(yù)后復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達(dá)顯著較預(yù)后未復(fù)發(fā)患兒血管瘤組織更高，且該指標(biāo)與血管瘤表面積、深度、MVD均表現(xiàn)出明顯正相關(guān)性，提示血管瘤組織可發(fā)生Cyclin G1過表達(dá)狀態(tài)，表達(dá)量越高可反映腫瘤處于增殖期，由于抑制p53活性，細(xì)胞周期控制失效，腫瘤擴(kuò)張更快，預(yù)后效果更差，但具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步基礎(chǔ)試驗研究確證。本研究還發(fā)現(xiàn)，PTEN聯(lián)合Cyclin G1蛋白聯(lián)合檢測，可較為準(zhǔn)確預(yù)測血管瘤患兒預(yù)后復(fù)發(fā)情況，究其原因可能與兩種蛋白從不同路徑共同影響血管瘤細(xì)胞周期與生物學(xué)行為有關(guān)，因而聯(lián)合檢測對病理機(jī)制研究與預(yù)后判斷有重要意義。Li等[15]認(rèn)為，Cyclin G1蛋白能借助與蛋白磷酸酶2A結(jié)合，促使泛素蛋白連接酶去磷酸化，從而加劇p53泛素化作用，腫瘤細(xì)胞失去負(fù)性調(diào)節(jié)而走向惡變，蛋白磷酸酶2A受到PTEN負(fù)性控制，因此同時檢測PTEN、Cyclin G1對早期辨識腫瘤惡變行為尤其關(guān)鍵。

血管瘤組織表達(dá)PTEN蛋白較為沉默，表達(dá)Cyclin G1蛋白較為活躍，尤其增殖期與預(yù)后復(fù)發(fā)病灶組織含量偏離明顯，兩者表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞周期運(yùn)行、細(xì)胞增殖等行為均存在一定關(guān)系，免疫組織化學(xué)檢測可幫助臨床了解血管瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)病理機(jī)制，并對患兒預(yù)后作出較為準(zhǔn)確的預(yù)測，為早期預(yù)防性干預(yù)措施提供參考。

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