自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼對老年患者慢性創(chuàng)面愈合的影響

陸揚(yáng)

[摘要]目的：探討自體脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）聯(lián)合外膜敷貼對老年患者慢性創(chuàng)面生長因子的影響。方法：選取筆者醫(yī)院2014年2月-2019年2月收治的老年慢性創(chuàng)面患者84例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組、觀察組，各42例。對照組采用外膜敷貼（無菌生物護(hù)創(chuàng)膜）治療，觀察組采用自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼治療。在患者治療2個月后復(fù)查時評估創(chuàng)面愈合效果。分別在治療前、治療2個月時取創(chuàng)面組織檢測兩組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血小板衍化生長因子（PDGF）水平，觀察創(chuàng)面生長因子的變化。分析兩組微血管計數(shù)（MVD）的變化，并記錄兩組創(chuàng)面愈合時間與并發(fā)癥發(fā)生率。結(jié)果：觀察組愈合率為92.86%顯著高于對照組76.19%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組治療后bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性表達(dá)率均高于治療前，且觀察組較對照組顯著增高（P<0.05）。觀察組MVD計數(shù)為（38.53±2.45）個，較對照組的[（30.41±3.04）個]更高（P<0.05）。觀察組愈合時間為（47.53±5.47）d少于對照組的（55.39±3.86）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組創(chuàng)面感染、破潰、皮膚壞死發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：與單用外膜敷貼相比，老年慢性創(chuàng)面患者經(jīng)自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼治療，能上調(diào)bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性表達(dá)率，提高M(jìn)VD計數(shù)，縮短愈合時間，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，療效更好。

[關(guān)鍵詞]慢性創(chuàng)面;自體脂肪源性干細(xì)胞;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;表皮生長因子;并發(fā)癥;老年患者

Abstract： Objective? To investigate the effect of autologous adipose-derived stem cells （ADSCs） combined with adventitia dressing on growth factor in elderly patients with chronic wounds. Methods? 84 elderly patients with chronic wounds admitted to our hospital from February 2014 to February 2019 were selected and divided into the control group and the observation group according to random number table method， 42 cases in each group. The control group was treated with adventitia application， while the observation group was treated with autologous ADSCs combined with adventitia application. The effect of wound healing was evaluated after 2 months of treatment.The levels of basic fibroblast growth factor （bFGF）， epidermal growth factor （EGF）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and platelet-derived growth factor （PDGF） were measured before treatment and 2 months after treatment.The changes of microvessel （MVD） count were analyzed， and the healing time and complication rate were recorded. Results? The healing rate of the observation group （92.86%） was significantly higher than that of the control group （76.19%）， the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive rates of bFGF， EGF， VEGF and PDGF in the two groups after treatment were higher than those before treatment， and the positive rates in the observation group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. The MVD count in the observation group was （38.53±2.45）， higher than that in the control group （30.41±3.04， P<0.05）. The mean healing time of the observation group was （47.53±5.47）d， which was significantly shorter than that of the control group [（55.39±3.86）d， P<0.05）. There was no difference in the incidence of wound infection， ulceration and skin necrosis between the two groups （P>0.05）. Conclusion? Compared with the single application of external membrane， ADSCs combined with external membrane can increase the positive expression rate of bFGF， EGF， VEGF and PDGF， increase the MVD count， shorten the healing time， promote the wound repair and improve the curative effect.

Key words： chronic wound; autologous adipose-derived stem cells; basic fibroblast growth factor; epidermal growth factor; complication; elderly patients

慢性創(chuàng)面的治療具有一定難度，大多因壓力性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、糖尿病性潰瘍等因素所致[1]。既往采用常規(guī)換藥方式治療，創(chuàng)面愈合需要較長時間，尤其對慢性創(chuàng)面而言，部分患者長期遷延不愈，不僅增加醫(yī)療費(fèi)用，而且加大了患者痛苦[2-3]。研究表明慢性創(chuàng)面延遲愈合的發(fā)生與多種因素有關(guān)，常見原因為新生血管形成障礙，這是導(dǎo)致創(chuàng)面不愈合的重要因素[4]。近年來，自體脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）在慢性創(chuàng)面治療中被應(yīng)用，體現(xiàn)出眾多優(yōu)勢，如取材方便、培養(yǎng)方便、來源豐富等，它對黏膜功能恢復(fù)有促進(jìn)作用[5]。本研究旨在分析ADSCs聯(lián)合外膜敷貼對老年患者慢性創(chuàng)面生長因子的影響，進(jìn)一步了解其治療價值，做如下報道。

1? 資料和方法

1.1 一般資料：選取筆者醫(yī)院2014年2月-2019年2月收治的老年慢性創(chuàng)面患者84例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法分成對照組、觀察組，各42例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲;②因糖尿病足、燒傷等引起的慢性創(chuàng)面;③經(jīng)常規(guī)換藥治療達(dá)30d，創(chuàng)面未愈;④未見骨、肌肉、肌腱病變;⑤既往無皮瓣種植史;⑥知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血液系統(tǒng)疾病;②心、腦、肺等臟器不全;③處于昏迷狀態(tài);④既往有精神、認(rèn)知障礙史;⑤惡性腫瘤。

1.3 方法：兩組均行清創(chuàng)處理，將壞死組織清除，按照藥敏試驗、細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果給予抗感染處理。對照組采用外膜敷貼（無菌生物護(hù)創(chuàng)膜）治療，碘伏對創(chuàng)面予以消毒，按照創(chuàng)面大小、形態(tài)對無菌護(hù)創(chuàng)膜給予裁剪，然后貼于創(chuàng)面，每隔3～7d對外膜敷貼進(jìn)行1次更換。觀察組采用自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼治療，無菌生物護(hù)創(chuàng)膜治療與對照組相同，在自體ADSCs抽取前行常規(guī)血液檢查，于大腿外側(cè)（下腹部也可）抽取脂肪約20ml，離心5min（1 000r/min），獲取下層細(xì)胞、上層脂肪細(xì)胞。取膠原酶（濃度為0.1%）、胰蛋白酶（濃度為0.1%）加入脂肪組織內(nèi)，水?。?7℃）30min，離心5min（2 000r/min），獲得下層細(xì)胞，充分混勻，經(jīng)PBS重懸，離心5min（2 000r/min）。連接培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察，每隔3d進(jìn)行1次換液，當(dāng)原代細(xì)胞融合達(dá)到90%后行傳代培養(yǎng)。經(jīng)消化處理后凍存，第2天存放于液氮內(nèi)，使用前行復(fù)蘇處理。每次取1×106/cm?細(xì)胞量注于創(chuàng)緣和基底，1次/2周。

1.4 觀察指標(biāo)：①創(chuàng)面愈合效果[6]：在患者治療2個月后復(fù)查時評估療效。治愈：創(chuàng)面組織顏色與周圍正常皮膚基本相同，局部無壓痛、疼痛表現(xiàn)，無膿液、紅腫癥狀;有效：創(chuàng)面顏色改善，局部有輕度疼痛、紅腫;無效：治療前、后癥狀無改善。總有效率=（治愈+有效）例數(shù)/總例數(shù)×100%;②創(chuàng)面生長因子：分別在治療前、治療2個月后取創(chuàng)面組織（4mm×4mm），行HE染色，經(jīng)免疫組化法測定堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍化生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）水平，由3名醫(yī)師計數(shù)，利用光學(xué)顯微鏡（400倍）進(jìn)行觀察;③微血管計數(shù)（Micro vessel density，MVD）與愈合時間：在治療1個月時，取肉芽組織行CD31兔抗人多克隆抗體HE染色，將呈棕色內(nèi)皮細(xì)胞簇視作一個MVD，分別利用低、高倍鏡觀察5個視野，取均值作為最終MVD結(jié)果，并記錄兩組患者的愈合時間;④并發(fā)癥：包括創(chuàng)面感染、破潰、皮膚壞死等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：經(jīng)SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用（%）表示，行χ2檢驗，等級資料行秩和檢驗。計量資料用（x?±s）表示，行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 兩組愈合效果比較：觀察組總有效率為92.86%較對照組明顯增高（76.19%），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 兩組治療前后創(chuàng)面生長因子水平比較：兩組治療前創(chuàng)面內(nèi)bFGF、EGF、VEGF、PDGF比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;兩組治療后bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性表達(dá)率均高于治療前，且觀察組較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 兩組MVD計數(shù)、愈合時間比較：觀察組MVD計數(shù)為（38.53±2.45）個顯著高于對照組的[（30.41±3.04）個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組愈合時間為（47.53±5.47）d短于對照組的（55.39±3.86）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 兩組并發(fā)癥發(fā)生情況比較：兩組創(chuàng)面感染、破潰、皮膚壞死發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。

2.5 典型病例：王某，男，65歲，因燒傷導(dǎo)致慢性創(chuàng)面形成，入院后行自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼修復(fù)治療，經(jīng)干預(yù)后，創(chuàng)面恢復(fù)良好（見圖1），局部未見組織壞死、破潰、創(chuàng)面感染等表現(xiàn)。

3? 討論

慢性創(chuàng)面是外科治療的一大難題，隨著人口老齡化進(jìn)展，因壓瘡、糖尿病足引起的慢性創(chuàng)面發(fā)生率逐年增高，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[7]。傳統(tǒng)換藥治療效果欠佳，為了改善療效，臨床需尋求更好的治療方式。目前，無菌生物護(hù)創(chuàng)膜（外膜敷貼）在慢性創(chuàng)面治療中被應(yīng)用，取得了一定療效。無菌生物護(hù)創(chuàng)膜為半透明生物薄膜，主要材料為豬內(nèi)臟膜，通過除抗原、消毒等處理后制作而成。該產(chǎn)品具備良好的透氣性、柔韌性，研究發(fā)現(xiàn)該護(hù)創(chuàng)膜對急性創(chuàng)面的治療效果良好[8]。但有研究指出針對慢性創(chuàng)面者單純給予護(hù)創(chuàng)膜治療，效果欠佳[9]。

鑒于既往常規(guī)治療效果不理想，本研究選用了新型治療方式，即在常規(guī)外膜敷貼基礎(chǔ)上采用自體ADSCs治療，結(jié)果提示該方案能提高愈合效果，并上調(diào)多種創(chuàng)面生長因子水平，包括bFGF、EGF、VEGF、PDGF。bFGF表達(dá)對膠原生成有較大影響，能誘導(dǎo)膠原生成，修復(fù)創(chuàng)面損傷[10]。EGF是生長因子中的一員，對細(xì)胞增殖、分化有調(diào)節(jié)作用，能與EGFR相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)[11]。研究表明EGF對內(nèi)細(xì)胞、表皮細(xì)胞增殖存在促進(jìn)作用，可促進(jìn)細(xì)胞遷移，能加速創(chuàng)面愈合[12]。VEGF已被證實對血管生長有刺激作用，它能促進(jìn)血管新生[13]。值得注意的是，因病理改變引起的VEGF表達(dá)增高，可導(dǎo)致血管異常增生，誘發(fā)腫瘤進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)VEGF對骨組織分化有益，有利于提升皮瓣存活率[14]。PDGF通常源自血小板，它屬于促細(xì)胞分裂劑，可促進(jìn)細(xì)胞分化、分裂[15]。研究指出PDGF可調(diào)節(jié)纖維母細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，可促使其聚集于創(chuàng)面，且對細(xì)胞外基質(zhì)降解有促進(jìn)作用[16]。筆者發(fā)現(xiàn)自體ADSCs治療能提高bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性表達(dá)率，這為創(chuàng)面愈合提供了良好的內(nèi)環(huán)境。該方案能分化對創(chuàng)面修復(fù)有益的細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等。動物實驗提示ADSCs對創(chuàng)面的修復(fù)能力較強(qiáng)，且能減輕炎癥，并促使表皮厚度提升，成骨能力、成脂能力均良好，能提升修復(fù)質(zhì)量[17-18]。此外，觀察組同時使用創(chuàng)膜敷貼治療。這種護(hù)創(chuàng)膜實際上是豬內(nèi)臟膜，內(nèi)含豐富膠原蛋白，經(jīng)滅菌處理后，能用于創(chuàng)面修復(fù)，具有柔韌性好、透氣性佳、組織相容性好等特點，可促使創(chuàng)面滲出減少，對創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用[19]。筆者發(fā)現(xiàn)自體ADSCs的應(yīng)用能進(jìn)一步上調(diào)bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性率，從而提升療效。

MVD計數(shù)與創(chuàng)面愈合療效密切相關(guān)，若患者存在新生血管形成障礙，則會導(dǎo)致MVD計數(shù)減少，不利于創(chuàng)面修復(fù)。筆者發(fā)現(xiàn)觀察組MVD計數(shù)高于對照組，進(jìn)一步證實ADSCs的療效可靠。其機(jī)制可能在于ADSCs為血管生成提供了良好條件，而新生血管形成能促進(jìn)創(chuàng)傷部位愈合[20]。本研究提示觀察組愈合時間較對照組縮短，這也提示在外膜敷貼基礎(chǔ)上加用ADSCs，有利于創(chuàng)面修復(fù)，從而將愈合時間縮短。筆者發(fā)現(xiàn)兩組并發(fā)癥發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，本次兩組并發(fā)癥率均較低，但臨床醫(yī)師仍需密切關(guān)注并發(fā)癥情況，降低不良事件風(fēng)險。

綜上，與單用外膜敷貼相比，老年慢性創(chuàng)面患者經(jīng)自體ADSCs聯(lián)合外膜敷貼治療，能取得更確切療效，這可能與該方案上調(diào)bFGF、EGF、VEGF、PDGF陽性率有關(guān)，有利于提高M(jìn)VD計數(shù)，縮短愈合時間，整體療效較理想。此外，本研究也有不足，如僅選取84例樣本，且設(shè)置的觀察時點較少，日后需進(jìn)一步增加樣本量與觀察時點進(jìn)行探討。

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