黃芩主要成分黃芩甙的測定及體外抑菌作用研究

葉英劍 李啟彬 劉園園

作者單位：463000 河南 駐馬店，駐馬店市食品藥品檢驗所

抗生素的使用雖使眾多細菌感染性疾病得到了有效控制，但由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致了耐藥菌株的增加，降低了現(xiàn)有抗生素的效率［1］，盡管專家學(xué)者仍在不斷努力研制新的抗生素，但新抗生素的研發(fā)生產(chǎn)明顯跟不上耐藥菌株形成的速度［2］。雖然我國從20世紀40年代就開始進行傳統(tǒng)中藥的體外抑菌實驗，證明了大批中藥對細菌的抑制作用［3］，且近年來，隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，中藥湯劑、濕潤燒傷膏等中藥制劑在預(yù)防和控制細菌感染性疾病方面也發(fā)揮了積極作用［4-5］。但由于中藥成分的復(fù)雜性、抑菌實驗方法的差異性以及中藥抑菌作用統(tǒng)一判定標準的缺乏等原因，人們對中藥抑菌作用的認識還存在明顯誤區(qū)。為進一步發(fā)掘中藥的抑菌作用，為中藥抑菌作用的應(yīng)用提供理論依據(jù)，筆者鑒于黃芩在臨床中的應(yīng)用較為廣泛，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實其具有抑菌作用［6］，但對其有效成分提取物的測定及抑菌性能的研究較少，遂于本研究中對其有效分黃芩甙的測定及抑菌作用進行了研究分析。

1 主要實驗材料及設(shè)備

中藥黃芩：購于駐馬店炎黃大藥房；枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、沙門氏桿菌、綠膿桿菌菌種：馬同長中醫(yī)藥生物研究所提供；黃芩甙標準品：中國藥品生物制品檢定所提供；氫氧化鈉、無水乙醇：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供；蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；自動平衡離心機、數(shù)顯恒溫水浴箱：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠提供；紫外可見分光光度計：上海申安醫(yī)療器械廠提供。

2 實驗方法

2.1 黃芩甙的提取

煎煮法：黃芩打磨成粉后，取黃芩粗粉40 g溶于10倍量蒸餾水中，微沸加熱2 h，濾出提取液；而后加入8倍量蒸餾水，再次微沸加熱2 h，濾出提取液；合并兩次提取液并過濾，濾液濃縮干燥成干浸膏；用少量蒸餾水溶解干浸膏，加熱至40℃，滴加2 mol／L鹽酸，將其pH值調(diào)節(jié)至約1.5，40℃恒溫靜置60 min，室溫靜置12 h；4000 r／min離心20 min，倒出上清液，蒸餾水洗滌沉淀2次后，55℃下干燥至恒重。

溫浸法：取黃芩粗粉40 g溶于10倍量蒸餾水中，80℃水浴加熱2 h，濾出提取液；而后加入8倍量蒸餾水，再次80℃水浴加熱2 h，濾出提取液；合并兩次提取液后按照煎煮法提取黃芩甙。

超聲波法：取黃芩粗粉40 g溶于10倍量蒸餾水中，超聲提取50 min，濾出提取液；而后加入8倍量蒸餾水，再次超聲提取50 min，濾出提取液；合并兩次提取液后按照煎煮法提取黃芩甙。

加堿溫浸法：取黃芩粗粉40 g溶于10倍量pH值為10的氫氧化鈉溶液中，80℃水浴加熱2 h，濾出提取液；而后加入8倍量pH值為10的氫氧化鈉溶液，再次80℃水浴加熱2 h，濾出提取液；合并兩次提取液后按照煎煮法提取黃芩甙。

醇提法：取黃芩粗粉40 g溶于10倍量70%乙醇溶液中，回流提取2 h，濾出提取液；而后加入8倍量70%乙醇溶液，再次回流提取2 h，濾出提取液；合并兩次提取液后按照煎煮法提取黃芩甙。

2.2 黃芩甙的含量測定及藥液制備

稱取干燥黃芩甙樣品25 mg置于50 mL容量瓶中，加入50%乙醇40 mL，水浴加熱至完全溶解，冷卻至室溫后再次加入50%乙醇至50 mL；微量加液器吸取2.5 mL溶液置于100 mL容量瓶中，50%乙醇定容，紫外可見分光光度計測定吸光度值。

經(jīng)對比分析顯示，加堿溫浸法為黃芩甙的最佳提取方法，故再次采用加堿溫浸法提取黃芩甙 （方法同上）。將提取所得的黃芩甙用蒸餾水定容至30 mL，115℃下滅菌10 min后放入冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 培養(yǎng)基的制備及抑菌活性的測定

固體培養(yǎng)基的制備：燒杯內(nèi)加適量蒸餾水后，依次加入牛肉浸膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂2%、氯化鈉5 g，然后再次加入蒸餾水至1000 mL；繼而加入10%氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.2～7.4，115℃下高壓滅菌20 min后備用。液體培養(yǎng)基的制備：在固體培養(yǎng)基制備過程中去掉瓊脂，其他方法不變。

菌落的培養(yǎng)：將菌種分別接種于8 mL液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)18～20 h后，用生理鹽水校正菌液濃度至1×105～1×106CFU／mL。

濾紙片平板擴散法檢測抑菌活性：將定性濾紙裁剪成直徑為5 mm的圓片并高壓滅菌、100℃烘干后，置于黃芩甙藥液中浸泡60 min，繼而烘干備用；將固體培養(yǎng)基置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，吸取0.1 mL菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面；將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面后，置于37℃中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。實驗重復(fù)3次，取平均值。

試管稀釋法檢測最小抑菌濃度：取黃芩甙，配制100 mg／mL原液；取10支試管編號后每支加入2 mL液體培養(yǎng)基，并于1號試管內(nèi)加入2 mL黃芩甙原液混勻后取出2 mL混合液加入2號試管內(nèi)，再將2號試管內(nèi)液體混勻后取出2 mL混合液加入3號試管內(nèi)……直至10號試管內(nèi)加入2 mL 9號試管混合液，配制成濃度依次為 50.00 mg／mL、 25.00 mg／mL、12.50 mg／mL、 6.25 mg／mL、 3.13 mg／mL、 1.56 mg／mL、0.78 mg／mL、 0.39 mg／mL、 0.20 mg／mL、 0.10 mg／mL的黃芩甙液體培養(yǎng)基；然后，每支試管內(nèi)加入0.1 mL菌液，37℃下培養(yǎng)20～24 h，觀察各試管內(nèi)藥液變化情況，若藥液澄清則為有抑菌作用，若藥液混濁則為無抑菌作用。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法提取黃芩甙含量對比

加堿溫浸法提取黃芩甙含量最高，溫浸法提取黃芩甙含量最低 （表1）。

表1 不同提取方法提取黃芩甙含量對比Table 1 Comparison of baicalin content extracted by different extraction methods

3.2 黃芩甙對不同菌群抑菌活性及最小抑菌濃度對比

黃芩甙對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌作用相對較強，對沙門氏桿菌抑菌作用相對較弱 （表2）。

4 討論

《傷寒論》 《溫病條辨》等中醫(yī)著作中的眾多描述與現(xiàn)代感染性疾病十分相似，并且記載了大量方藥，且眾多方藥至今仍廣為應(yīng)用，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示的由于中藥的特殊性，其治療效果受菌株耐藥性的影響較小不謀而合。因此，研發(fā)抗菌中藥對解決耐藥菌株的產(chǎn)生和抗生素短缺等問題具有重要意義［7］。

目前，國內(nèi)外眾多研究學(xué)者對大量中草藥進行了抑菌作用研究，如陳星燦等［8］篩選出五倍子、丁香等中藥對福氏志賀氏菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等致病菌均有較強的抑制和殺滅作用。筆者鑒于部分研究顯示，黃芩作為我國傳統(tǒng)中藥，其有效成分也對多種細菌表現(xiàn)出抑制作用，遂于本研究中對不同提取方法提取其有效成分黃芩甙的含量進行了測定，并對其抑菌活性和最小抑菌濃度進行了對比分析。結(jié)果顯示，黃芩甙提取率由高到低的方法依次為加堿溫浸法、醇提法、超聲波法、煎煮法、溫浸法，考慮可能與黃酮類物質(zhì)多具有酚羥基，易溶于堿；黃芩甙具有脂溶性，易溶于醇；超聲的空化效應(yīng)具有粉碎、攪拌等特殊作用，利于黃芩甙與水相互滲透、溶解有關(guān)［9-11］。且黃芩甙對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌作用相對較強，對沙門氏桿菌抑菌作用相對較弱，具體作用機制有待進一步深入研究探討。

表2 黃芩甙對不同菌群抑菌活性及最小抑菌濃度對比Table 2 Comparison of bacteriostatic activity and minimum inhibitory concentration of baicalin against different floras

綜上所述，加堿溫浸法是黃芩甙的最佳提取方法，黃芩甙對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌作用相對較強，對沙門氏桿菌抑菌作用相對較弱，具體作用機制有待進一步深入研究探討。另外，值得注意的是，微生物感染性疾病的發(fā)生與治療應(yīng)為微生物、機體、藥物三者之間相互作用的辨證關(guān)系，而目前的研究多為藥物與微生物之間的關(guān)系，尚缺乏感染性疾病整體病理過程的研究，未能闡釋中藥標本兼治的功效及優(yōu)勢，有待進一步完善［12］；中藥的應(yīng)用多為復(fù)方制劑，而研究多只涉及單味藥物，藥物配伍后的協(xié)同及拮抗作用未能體現(xiàn)，有待進一步加強［13］。