GNA13在多種惡性腫瘤中的研究進展

朱偉力 馬繼偉， 周赫 鄧暢 奚悅 夏明 趙苗青，★

近年來，隨著分子診斷技術在臨床中的廣泛應用，其對于腫瘤的早期診斷以及預后治療有著極其重要的臨床意義。G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是己知的體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族，而G12亞家族中的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基13（Guanine nucleotide binding protein alpha 13，GNA13）被認為與癌基因轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞生長密切相關。有學者發(fā)現(xiàn)GNA13在人類的許多惡性腫瘤中表達上調(diào)，特別是在侵襲性強的乳腺癌和前列腺癌中；而且，GNA13的上調(diào)會促進這些惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。因此，本文以GNA13在腫瘤細胞中的信號轉(zhuǎn)導機制為思路，總結其在惡性腫瘤中的作用機制及生物學特性。

1 G蛋白及G蛋白偶聯(lián)受體的結構及其功能

G蛋白是一類信號轉(zhuǎn)導蛋白，又稱為GTP結合蛋白，種類大約有40余種，可將外界信號傳遞至細胞內(nèi)，進而激活下游的各種信號通路[1]。GPCRs是一大類膜蛋白受體的簡稱，又稱為七次跨膜受體[2]。GPCRs 被配體激活以后，通過G蛋白將細胞信號傳導至下游效應子，進而調(diào)控細胞的生長代謝和改變細胞骨架結構等活動[3]。被激動劑（激素、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子等）激活后的GPCRs 可以充當鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEF），進而催化GDP 交換Gα 亞基上的GTP。與GTP結合后，Gα與Gβγ分離的同時激活下游效應子，包括腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和Rho 鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors for Rho，RhoGEFs）等，進而開啟不同的信號轉(zhuǎn)導通路[3]。Gα（12/13）家族通路通過含有G蛋白信號調(diào)節(jié)因子同源結構域的Rho-GEFs 將信號傳遞給Rho 蛋白，從而調(diào)節(jié)細胞生長、基因轉(zhuǎn)錄和細胞骨架肌動蛋白的重排等[4]（見圖1）。

2 GNA13的發(fā)現(xiàn)及功能研究

1991年Strathmann和Simon 在克隆小鼠中發(fā)現(xiàn)了G12亞家族中的Gα12和Gα13，它們的分子量約為44kDa。Gα12和Gα13 分別是由鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α 亞基12（Guanine nucleotide binding protein alpha 12，GNA12）和GNA13 編碼[5]。在人類中，GNA12 位于7號染色體上，GNA13 位于17號染色體上。GNA12 與GNA13 幾乎在所有組織中都有表達，但是它們的表達都是十分保守的，并參與多種生理和發(fā)育過程[12]。研究表明，血管緊張素II，血栓烷A2，1-磷酸鳥苷-磷酸和溶血磷脂酸等都可以與GNA12/GNA13 耦聯(lián)。同時，GNA12和GNA13組成的G12亞家族增強了與細胞分裂、增殖、遷移侵襲和腫瘤發(fā)生等許多病理生理活動[6]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多與GNA12/GNA13 直接或間接相互作用的蛋白，其中包括RhoGEFs 蛋白家族所介導的信號轉(zhuǎn)導通路，其調(diào)控著細胞增殖分化及腫瘤性轉(zhuǎn)化[7]。由于該蛋白家族存在G蛋白信號調(diào)節(jié)因子結構域，因此GNA12和GNA13 可以通過該結構域與RhoGEFs 結合，將其從細胞質(zhì)募集到胞膜上，并激活RhoGEFs，從而發(fā)揮鳥嘌呤交換因子的功能，以此來促使GTP 與RhoA 結合，進而引起細胞的形態(tài)改變以及收縮和遷移[8]?，F(xiàn)已從Rho-GEFs 亞家族中鑒定出3種蛋白，包括p115-Rho-GEFs、PDZ-RhoGEFs和白血病相關的RhoGEFs（Leukaemia Associated RhoGEFs，LARG）[9]。研究表明，GNA13（非GNA12）可以直接刺激LARG和p115-RhoGEFs 的GEF 活性[10]。在體外的實驗發(fā)現(xiàn)，GNA13 能夠激活p115-RhoGEFs 或非磷酸化的LARG，而GNA12 通常激活酪氨酸磷酸化的LARG，因此，p115-RhoGEFs和LARG是GNA12/GNA13的GTP 酶激活蛋白，且它們是GNA12/GNA13 所特有的，而PDZ-RhoGEFs 不具有此功能[11]。實驗表明，GNA12/GNA13 通過與RhoGEFs的相互作用誘導RhoA 的活性。同時，P115-Rho-GEFs或LARG的RH結構域表現(xiàn)出GNA12和GNA13的特異性GTPase 活化蛋白活性。因此，RH-RhoGEFs 在單個分子的范圍內(nèi)既起到了GTPase 活化蛋白的作用，又起到了GNA12 或GNA13的效應作用[12]。

Offermanns 等[13]發(fā)現(xiàn)GNA12/GNA13的功能十分重要。因為GNA12 敲除的小鼠表現(xiàn)正常，而GNA13 敲除的小鼠在胚胎第9.5 天由于其血管系統(tǒng)發(fā)育不正常而死亡。GNA12和GNA13 同時敲除的小鼠也在胚胎第8.5 天死亡。而只攜帶一個完整GNA13等位基因的GNA12 敲除的小鼠也會在子宮中死亡。GNA13 除了在胚胎循環(huán)系統(tǒng)中的作用外，其在人體各種病理過程中也成為了關鍵因素，例如，卵巢經(jīng)歷激素調(diào)節(jié)的變化，表現(xiàn)為卵巢卵泡生長并伴有卵巢的擴張。GNA13 介導的信號通路還涉及到例如VEGFR-2表達、涉及小GTPase RhoA和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的激活[14]。

在分子診斷中也顯示出GNA13的意義，Kim等[15]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌，GNA12和GNA13 誘導基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 上調(diào)，導致MCF10A 細胞產(chǎn)生侵襲和遷移表型。通過觀察人的乳腺組織樣本，證明了G12蛋白家族和MMP-2 的表達水平與癌癥的診斷密切相關（P＜0.005）。Cheng 等[16]發(fā)現(xiàn)，從正?？谇徽衬吮荆∟OM）到口腔上皮異常增生（OED）到口腔鱗狀細胞癌（OSCC），GNA12 的表達逐步升高，這表明GNA12 的過表達可能是口腔癌發(fā)生的早期表現(xiàn)，并且可能在口腔癌的進展中起關鍵作用，而GNA13 或許也有同樣的作用。因此GNA12/GNA13 可能將為某些癌癥提供臨床診斷證據(jù)或成為新型腫瘤標志物。

3 GNA13與多種惡性腫瘤的關系

在發(fā)現(xiàn)G12家族后不久，GNA12和GNA13都被證明具有誘導成纖維細胞致癌轉(zhuǎn)化的能力[24]。因此，GNA13與各種惡性腫瘤之間的生物學關系成為了研究者關注的焦點問題。

3.1 GNA13與乳腺癌

Rasheed 等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，GNA13 能與GPCRs 相互作用促進下游信號分子的傳導，從而造成惡性腫瘤的侵襲和遷移。乳腺癌細胞是依賴于GNA13的表達來實現(xiàn)細胞侵襲，GNA13 參與導致乳腺癌發(fā)展的轉(zhuǎn)錄后基因表達機制是通過微小RNA（microRNA，miRNA）來調(diào)控的。miRNA 與目的基因的mRNA 緊密聯(lián)系，同時抑制其蛋白的表達，miRNA 與編碼序列或目標基因3′-UTR 的結合可致使mRNA 降解過程或蛋白翻譯過程受到影響，最終抑制靶基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)。與前列腺癌細胞不同，乳腺癌細胞中GNA13的表達主要是通過miR-31 而不是通過miR-182和miR-200a 調(diào)控的。同時研究證明miR-31 直接與GNA13的mRNA 結合，并且這種結合會影響GNA13 表達和乳腺癌細胞侵襲。Vrba 等[18]發(fā)現(xiàn)，miRNA 表達失調(diào)能夠顯著表現(xiàn)出來，其中miRNA 可以充當“致癌miR”或“腫瘤抑制miR”，而這一過程其可以通過靶細胞中潛在的癌基因來實現(xiàn)。miR-31 在腫瘤進展中丟失，并促進乳腺癌和其他癌癥的遷移。因此，確定乳腺癌和其他癌癥中GNA13 調(diào)控的特定機制可能會導致針對這些癌癥的基于miRNA 的治療策略的發(fā)展。此外，miR-31 的缺失和GNA13的獲得可能是評估乳腺癌和其他癌癥的可行生物標志物。

3.2 GNA13與前列腺癌

Lim 等[19]發(fā)現(xiàn)單獨阻斷GNA13 會顯著影響前列腺癌的癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。GNA13 通過Rho GTPases 發(fā)揮作用，以驅(qū)動NF-κB 轉(zhuǎn)錄來誘導前列腺癌細胞中CXCL5 的表達。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞中，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的CXCL5 水平顯著提高，并通過促進血管生成來誘導腫瘤細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，這是由于GNA13 通過誘導內(nèi)皮細胞中的VEGFR-2 或誘導細胞促進血管生成的CXCL1、CXCL2和CXCL4 來誘導腫瘤細胞血管的生成，進而影響腫瘤的生長。當列腺癌細胞中GNA13 表達沉默后，促血管生成基因會大量丟失。Rasheed等[17]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，僅野生型GNA13的丟失就可能顯著降低前列腺癌細胞在體外的浸潤和轉(zhuǎn)移的機會。使用特定的miRNA 抑制劑抑制LnCAP 細胞中的miR-182和miR-141/200a 可提高GNA13的表達并增強對這些細胞的侵襲。這些數(shù)據(jù)證明GNA13是前列腺癌細胞侵襲的重要介質(zhì)。由于GNA13 可以充當前列腺癌細胞以及多種腫瘤細胞的致癌GPCRs 信號的共同介體，因此確定其失調(diào)機制可能會使新型miRNA 成為未來抑制癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的方法。因此，建立以GNA13 為目標的檢測方法對于早期診斷前列腺癌具有重要作用，同時以miR-182 等分子為靶標進行靶向治療的意義重大。

3.3 GNA13與肝癌

Xu 等[20]通過探討246例肝癌患者GNA13 表達與臨床病理特征的關系發(fā)現(xiàn)GNA13在肝癌組織中的顯著上調(diào)與多種臨床病理學參數(shù)相關，包括腫瘤多重性（P=0.004）、TNM 分期（P=0.002）和BCLC 分期（P=0.010），GNA13 表達是整體生存（P=0.014）和無瘤生存（P=0.005）的獨立預后因素。為了確定GNA13 對肝癌細胞增殖和侵襲的影響，其建立了穩(wěn)定表達GNA13的肝癌細胞HepG2和SMMC-7721。與對照組相比，GNA13的過表達在體外促進HepG2和SMMC-7721 細胞的細胞增殖；侵襲試驗證明，在HepG2和SMMC-7721 細胞中過表達GNA13 會使細胞侵襲能力顯著提高。通過免疫組化對肝癌細胞樣本評估GNA13 蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)GNA13 蛋白主要在肝癌的細胞質(zhì)中檢測到，正常肝組織主要表現(xiàn)為GNA13 陰性表達。因此，GNA13是肝癌致瘤過程中較為關鍵的一個影響因素，可以作為肝癌患者的預后生物標志物，特別是在行根治性肝切除術后的患者中，其中GNA13的高表達提示肝癌患者的預后較差。

3.4 GNA13與胃癌

Zhang 等[21]發(fā)現(xiàn)GNA13的上調(diào)可以促進胃癌（Gastric cancer，GC）細胞的致瘤性和增殖。在GC組織和細胞中，GNA13 表達水平顯著提高，并且與侵襲性的GC 進展程度和患者生存不良密切相關。當GNA13的表達水平增高時，其通過促進小鼠的細胞增殖速率、集落形成和腫瘤形成，從而增加了GC 細胞在體外和體內(nèi)的增殖和致瘤性。相比之下，敲除GNA13基因能夠有效地抑制GC 細胞在體外和體內(nèi)的增殖和致瘤性。GNA13在GC中發(fā)揮作用的分子機制包括通過上調(diào)c-Myc，激活AKT 信號通路和ERK 信號通路，同時抑制FOXO1的活性。通過上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來促使G1/ S 細胞周期發(fā)生轉(zhuǎn)變，進而調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1和CDK 抑制劑（p21Cip1和p27Kip1）的下調(diào)。因此，以p21Cip1和p27Kip1 等作為靶標可以對GC 的早期診斷或預后進展的監(jiān)測起到重要指導作用。

3.5 GNA13與頭頸部鱗癌

Rasheed 等[22]發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗癌（Head and neck squamous cell carcinoma，NHSCC）中，GNA13是耐藥性和預后不良的生物標志物，而且GNA13在體外和體內(nèi)都可調(diào)節(jié)HNSCC 細胞的發(fā)生和呈現(xiàn)腫瘤起始樣（Tumor initiating cells，TICs）表型，其通過NFκB和MAPK 信號通路促進TICs 表型和耐藥性。為了確定表達高水平GNA13的腫瘤的侵襲性是否與較差的治療反應有關，用順鉑，5-氟尿嘧啶（5-FU），紫杉醇，阿霉素或γ 電離輻射（IR）處理細胞，與低表達GNA13的細胞相比，高表達GNA13的細胞系對所有治療方式均具有抗性。低表達GNA13的細胞中能夠使得其對一些藥物（例如鉑類藥物）的敏感性升高2～3倍。高表達GNA13的細胞更早地開始促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展，其只需5000個細胞即可導致裸鼠成瘤。使用小分子抑制劑阻斷GNA13的表達或某些下游通路的表達，可以消除GNA13 誘導的TICs 表型，使癌細胞能接受標準的細胞毒性治療。這些數(shù)據(jù)表明，GNA13 對于HNSCC 細胞中與TICs 表型相關的所有性質(zhì)都是必要的。因此，GNA13 作為NHSCC 進展的潛在預后生物標志物，干擾GNA13 誘導的信號傳導就為阻斷TICs和降低HNSCC 耐藥性提供了新的方法，因此阻斷GNA 13 誘導的MAPK/AP-1或NFκB 信號通路，確實是一種針對TICs 誘導的腫瘤生長和治療NHSCC 耐藥性的策略。

3.6 GNA13與淋巴瘤

生發(fā)中心B細胞（Germinal center B cell，GCB）來源的彌漫性大B細胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，GCB-DLBCL）是一種常見的惡性腫瘤。Muppidi 等[23]發(fā)現(xiàn)GNA12和GNA13在GCB 細胞中均被上調(diào)，其中以GNA13 上調(diào)更為顯著。研究顯示在GCB-DLBCL 活檢樣本中頻繁出現(xiàn)GNA13 編碼突變，GNA13 缺陷足以在腸系膜淋巴結（mLNs）中賦予GCB 細胞生長優(yōu)勢，而在淋巴集結（PPs）中則具有較小的優(yōu)勢。GNA13 突變和BCL2 重排以及可能激活的突變經(jīng)常在GCBDLBCL 中同時發(fā)生。合并GNA13 缺陷和BCL2過表達的小鼠中的GCB 細胞顯示出更高的離體存活率。人類P2RY8 導致了對小鼠PPs和mLNs 中GCB 細胞生長的抑制作用，類似于S1PR2 過表達的作用，而這種抑制作用要求P2RY8 與GNA13 相偶聯(lián)，因為如果細胞缺少GNA13 則無法看到此生理現(xiàn)象。通過以上實驗發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的P2RY8 可以通過GNA13 依賴性途徑來抑制GCB 細胞的生長并促進B 細胞在GC 位置定位。Morin 等發(fā)現(xiàn)健康人體內(nèi)的GCB 由于受一些生理因素的影響，只能存在于生發(fā)中心內(nèi)部，無法進入到循環(huán)系統(tǒng)之中，而缺乏GNA13 時，會使得GCB 進入血液循環(huán)。經(jīng)測序研究發(fā)現(xiàn)，GNA13和S1PR2 突變則主要見于GCB來源的GCB-DLBCL?？傊?，GCB中的GNA13的丟失會造成抗細胞凋亡，同時體細胞會受到其誘導影響，發(fā)生高頻突變從而產(chǎn)生淋巴瘤[24-25]。因此，通過檢測P2RY8 的變化水平可以對GCB-DLBCL 的發(fā)生起到一定的診斷價值。

3.7 GNA13與肺癌

Grzelinski 等[26]發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）細胞中，各種自分泌刺激導致GNA12/GNA13的激活。在體外實驗中，GNA12/GNA13 雙重敲除完全消除了小鼠的H69 致瘤性，調(diào)節(jié)SCLC 細胞增殖的GPCRs 與GNA12/GNA13偶聯(lián)，導致Gq/11 磷脂酶C-Ras-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和GNA12/GNA13-Rho 信號傳導途徑的各自激活。在其他腫瘤中，GNA12/GNA13 激活可促進侵襲性而不影響細胞增殖，而GNA13的高表達在SCLC 中發(fā)揮增殖作用。GNA13的下調(diào)會明顯抑制體內(nèi)外的增殖，體內(nèi)數(shù)據(jù)還顯示了GNA12和GNA13 耗竭的累加效應，兩種蛋白質(zhì)的雙重靶向作用能導致腫瘤生長的完全消除，這一開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)進一步支持了完整的GNA12/GNA13 信號傳導是SCLC 中腫瘤生長的先決條件的概念。

3.8 GNA13與胰腺癌

Gardner 等[27]近期的研究表明，腫瘤微環(huán)境在胰腺癌等一些疾病的進展中的發(fā)揮著重要的作用，例如GNA13在溶血磷脂酸刺激引起的胰腺癌細胞侵襲性遷移中就產(chǎn)生了重要影響，從而影響著胰腺癌疾病的進展。研究證明LPA 特異性刺激胰腺癌細胞的遷移但不刺激其增殖，LPA 刺激的胰腺癌細胞的侵襲性遷移受到競爭抑制性基因GNA13 表達的抑制，并且shRNA 介導的GNA13沉默也證明了LPA 刺激的胰腺癌細胞遷移的類似抑制作用。GNA13是參與LPA 介導的胰腺癌遷移的α 亞基，即敲除GNA13 會導致細胞遷移受到抑制，這為胰腺癌的早期診斷提供了新的思路。

4 展望

GNA13在人體中的作用機制眾多且獨特，已被證明是癌細胞增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)劑[14，28]。雖然GNA13的高表達與常見腫瘤進展密切相關，并且GNA13所參與最重要的信號通路之一就是RhoGEFs家族所介導的，但仍需進一步研究以充分闡明GNA13 參與腫瘤轉(zhuǎn)移和進展的確切機制。相信通過深入研究GNA13 對細胞的增殖分裂、細胞骨架的重排、細胞的遷移與侵襲等生理病理活動產(chǎn)生的影響，闡明其發(fā)揮作用的分子機制，未來有望使其成為一個新的治療靶點。