青杄轉錄因子PwHAP5及其同源蛋白AtHAP5下游靶基因的鑒定1)

苗雅慧 游韓莉 郜銀濤 張凌云

(森林培育與保護教育部重點實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

HAP(histone or heme-associated protein)也叫做NF-Y(nuclear factor-Y)，是由3個亞基聚合而成的一類轉錄因子，包括NF-YA(HAP2)、NF-YB(HAP3)、NF-YC(HAP5)。這3個亞基可以形成異源三聚體，與CCAAT特異結合，共同參與下游靶基因啟動子DNA的結合與調(diào)控[1]。研究發(fā)現(xiàn)，HAP家族參與了葉綠體的生物發(fā)生、脂肪酸生物合成、花期、胚胎形成以及非生物脅迫過程等過程[2-7]，這其中大多基于HAP家族單個亞基進行功能探索。例如，大豆(Glycinemax)NF-YC2基因和小麥(TriticumaestivumL.)NF-YC3/5/8/9的表達受光調(diào)控，且GmNF-YC2在開花調(diào)節(jié)中起重要作用[8-9]；在擬南芥中過表達NF-YB2可以加速細胞分裂，促進主根的伸長[10]；楊樹(Populusdeltoides)PdNF-YB7能被滲透脅迫與ABA誘導，參與了植物對干旱的響應[11]。HAP家族調(diào)控的下游靶基因也陸續(xù)鑒定出來，例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtHAP5A可以通過與AtXTH21啟動子上CCAAT順式作用元件結合，調(diào)控植株對冷脅迫的響應[12]。

青杄(Piceawilsonii)是松科(Pinaceae)云杉屬常綠針葉樹種，又名華北云杉，為中國特有樹種，且被多個地區(qū)列為水源涵養(yǎng)林及用材林的主要造林和更新樹種[13-14]。本課題組前期在Ca2+誘導的青杄花粉cDNA文庫中篩選得到基因PwHAP5，發(fā)現(xiàn)其與PwFKBP12互作參與花粉管的導向調(diào)節(jié)[15]。另外PwHAP5能夠響應干旱、鹽漬等非生物逆境脅迫[16]，但其調(diào)控機制尚不清楚。

我們對青杄PwHAP5基因和擬南芥AtHAP5基因編碼的氨基酸序列進行同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)PwHAP5氨基酸序列與AtHAP5氨基酸序列的關鍵結構域保守[15]。對AtHAP5的候選靶基因進行預測，A37、HSFA2很可能是AtHAP5的靶基因。A37又被稱為PDX1.2，編碼一個具有磷酸吡哆醛合成酶活性的蛋白質(zhì)，參與了植物對高溫脅迫的響應過程[17-18]。在熱脅迫下，HSFA2屬于最強烈誘導的蛋白，在熱激脅迫調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮了關鍵的作用[19]。本研究在課題組前期研究基礎上，通過酵母單雜交、EMSA、雙熒光素酶等實驗探究PwHAP5和AtHAP5對A37、HSFA2的調(diào)控作用，旨在豐富并進一步闡明HAP5轉錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡。

1 材料與方法

以實驗室保存的哥倫比亞野生型擬南芥，athap5(At1g56170)突變體，AtHAP5同源過表達和PwHAP5(ACS31831.1)異源過表達種子為實驗材料，將各株系擬南芥種子用5%次氯酸鈉處理后播種于MS培養(yǎng)基中，黑暗4 ℃春化3 d后置于22 ℃、16 h光周期的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pEASY-T1載體、Trans1-T1大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)在北京全式金科技公司購買。酵母(Saccharomycescerevisiae)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)購自上海唯地生物科技有限公司。EMSA所用到的生物素標記探針、DNA鏈或者突變探針均在上海英濰捷基公司合成。pGBKT7、pGADT7、pGADT7-p53、pHis2、pHis2-p53、pAbAi、pAbAi-p53、pCAM1205、pGBKT7-ANAC092以及單熒光素酶實驗載體1300-LUC由本實驗室保存。pGreenII 0800-LUC、pGreenII 62-SK、pSoup-p19載體由清華大學謝道昕教授惠贈。

轉錄激活活性分析的步驟參照文獻[20]，簡要如下：將PwHAP5全長、AtHAP5全長以及PwHAP5的N端(1-101)和C端(102-201)分別構建到pGBKT7載體上,引物見表1。將構建好的載體轉化入酵母中，通過在含有10 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His-Ade缺陷型酵母培養(yǎng)基上的生長情況判定轉錄激活活性，以pGBKT7-ANAC092為陽性對照[21]。

pHIS2體系酵母單雜交的試驗方法參照上海唯地生物科技有限公司說明書。將濃度相同的pHIS2質(zhì)粒和pGADT7質(zhì)粒分別取10 μL和5 μL共轉入Y187酵母感受態(tài)細胞，在SD/-Trp-Leu酵母缺陷培養(yǎng)基中生長。長出菌落后，在超凈工作臺中將長出的菌落用無菌蒸餾水重懸，并將OD600值調(diào)整為0.2，吸取5 μL滴在含有篩選出的3-AT濃度的SD/-Trp-Leu-His的三缺培養(yǎng)基中倒置培養(yǎng)觀察生長情況。

將HSFA2和A37的啟動子全長以及只含有CCAAT box的啟動子片段構建到pAbAi載體上。用限制性內(nèi)切酶BstBI酶切線性化pAbAi-HSFA2/A37載體。回收酶切產(chǎn)物，將其轉入Y1HGold，用SD/-Ura培養(yǎng)基進行篩選。將陽性菌落制備成酵母感受態(tài)，將各pGADT7質(zhì)粒分別轉入所制備的含有線性化pAbAi-HSFA2/A37載體的Y1HGold感受態(tài)中，并于SD/-Ura-Leu二缺酵母培養(yǎng)板上生長。將長出的菌落進行菌落PCR，將陽性菌落稀釋，滴在SD/-Ura-Leu+AbA的酵母培養(yǎng)基中生長并進行觀察記錄。

蛋白的誘導純化參照文獻[22]。將AtHAP5構建到pET-32a載體上，在BL21菌株中表達。通過篩選不同IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間，發(fā)現(xiàn)最佳誘導條件為IPTG濃度為1 mM，誘導溫度25 ℃，最佳誘導時間為7 h。篩選出最佳誘導條件后，進行大量誘導和轉化。利用上海碧云天生化科技有限公司的His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白誘導與純化，與His標簽蛋白融合表達，進行Western blot驗證。EMSA實驗參考上海碧云天生化科技有限公司的EMSA試劑盒說明書。

單熒光素酶試驗方法參考文獻[22]。將pCM1205-AtHAP5和1300-LUC-HSFA2/A37質(zhì)粒分別轉入農(nóng)桿菌菌株GV3101。將等體積的pCM1205-AtHAP5的1300-LUC-HSFA2/A37農(nóng)桿菌混合后注射到一個月大的煙草葉片中，培養(yǎng)48 h后在熒光成像系統(tǒng)(Andor iXon)中進行觀察和拍照。

雙熒光素酶實驗方法參照文獻[23]、[24]。將pGreenII0800-LUC-HSFA2/A37(p0800-HSFA2/A37)和pGreenII 62-SK-AtHAP5 (p62-AtHAP55)的各組合分別共轉入含有pSoup-p19質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中，并進行煙草葉片注射。利用Promega化學發(fā)光檢測儀，進行LUC和RLUC的檢測。實驗設置3次重復。

利用北京艾德萊生物技術有限公司的RNA提取試劑盒提取植株的總RNA，并通過oligo(dT)法將總RNA反轉錄為cDNA[25]。利用所設計的RT引物(表1)進行RT-qPCR，以擬南芥ACTIN2/8基因作為內(nèi)參基因。試驗分別設置2次生物學重復，3次技術重復。

表1 所用引物序列

2 結果與分析

2.1 轉錄激活活性分析

圖1顯示，轉化空載體pBD、pBD-PwHAP5以及pBD-AtHAP5的酵母不能在SD/-Trp-His-Ade+10 mmol·L-13-AT缺陷型培養(yǎng)基中正常生長，而轉化陽性對照pBD-ANAC092的酵母可以在SD/-Trp-His-Ade+10 mmol·L-13-AT缺陷型培養(yǎng)基中正常生長，且可以使X-α-gal變藍，表明PwHAP5以及AtHAP5全長沒有轉錄激活活性。此外將PwHAP5分為N端和C端兩段，發(fā)現(xiàn)PwHAP5的N端和C端均無轉錄激活活性。

空載體pBD和pBD-ANAC092分別作為陰性和陽性對照，圖中蛋白后面的數(shù)字指示片段的位置。

圖1轉錄激活活性分析

2.2 酵母單雜交試驗

2.2.1 pHis2體系酵母單雜交

在前期試驗中，我們發(fā)現(xiàn)當3-AT濃度高達300 mmol·L-1時，才能消除組氨酸的背景表達。因此，后續(xù)實驗使用的3-AT濃度為300 mmol·L-1。在含有300 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基中，除了轉入的陽性對照質(zhì)粒pHIS2-p53+pAD-p53的酵母菌株可以生長，而其他實驗組都沒有長出菌落(圖2)。由此說明，在酵母pHIS2體系中，AtHAP5與PwHAP5均不能與HSFA2、A37啟動子結合。

2.2.2 pAbAi體系酵母單雜交

為了進一步確認pHIS2體系酵母單雜交的結果，又通過pAbAi體系進行了酵母單雜交。首先對pAbAi體系中pAbAi-HSFA2/A37的金擔子素(AbA)的背景表達進行了測試，如圖3A。當AbA濃度為500 ng·mL-1時，已經(jīng)能抑制陽性對照pAbAi-P53pro的生長，然而即使加大AbA的濃度到1 000 ng·mL-1時仍然抑制不住pAbAi-A37pro、pAbAi-HSFA2pro的AbA背景表達。由此可見，A37、HSFA2的啟動子極有可能被Y1HGold酵母內(nèi)源轉錄因子識別，或其啟動子本身存在激活活性，因此啟動子的全長不能用于酵母單雜交的篩選試驗。

圖2轉化酵母在含有300mmol·L-13-AT的SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基中生長情況

由于在pAbAi體系中，A37與HSFA2的啟動子全長不能直接用于酵母單雜交實驗，因此將A37與HSFA2的啟動子上含有CCAAT box作用元件的序列片段克隆出來，重新構建到pAbAi載體上，進行實驗。金擔子素背景檢測結果表明，當金擔子素濃度為300 ng·mL-1時，對照組和實驗組的背景表達均被消除了，因此確定金擔子素的實驗濃度為300 ng·mL-1。酵母單雜交結果發(fā)現(xiàn)，只有陽性對照能在含有300 ng·mL-1的二缺培養(yǎng)基上生長，陰性對照和實驗組沒有明顯菌落出現(xiàn)(圖3B)。由此可見，AtHAP5和PwHAP5不能與所克隆的HSFA2、A37啟動子上含有CCAAT box的順式作用元件區(qū)域結合。

2.3 原核蛋白誘導純化與EMSA試驗

采用碧云天生物科技有限公司的His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白的誘導與純化，得到目的蛋白(圖4A、B)。在EMSA試驗中，設置了5個組，分別為陰性對照(加入探針為CCAAT box突變探針)、樣品反應組(加入探針為生物素標記探針)、探針冷競爭(既有標記探針，又有未標記探針)、突變探針冷競爭(既有標記探針，又有未標記的突變探針)、Super-shift反應(加入His標簽蛋白抗體)。結果發(fā)現(xiàn)，各反應組中全為自由探針，均未發(fā)現(xiàn)滯后條帶。(圖4C、D)。

通過EMSA、酵母單雜交實驗可知，AtHAP5和PwHAP5不能與所克隆的HSFA2、A37啟動子上含有CCAAT box順式作用元件區(qū)域直接結合。

2.4 熒光素酶試驗

單熒光素酶試驗中，對照組空1205+A37、空1205+空1300、1205-AtHAP5+空1300及實驗組1205-AtHAP5+A37的熒光強度沒有明顯差別。然而，在實驗組1205-AtHAP5+HSFA2中熒光強度明顯減弱(圖5)。此外，利用靶基因啟動子后連接的熒光素酶基因(LUC)與雙熒光素酶系統(tǒng)中穩(wěn)定表達的海腎熒光素酶基因(RLUC)熒光信號強度的比值，進行定量分析，如表2所示。在實驗組p62SK-AtHAP5+HSFA2中，LUC/RLUC的比值顯著低于對照組(空p62+HSFA2)，而在實驗組p62SK-AtHAP5+A37中，LUC/RLUC的比值與對照組(空p62+A37)沒有顯著差別。因此，AtHAP5對A37表達無影響，但對HSFA2的表達具有負調(diào)控作用。

表2 雙熒光素酶LUC/RLUC熒光強度比值

注：對照組為空pGreenII 62-SK+pGreenII 0800-X-LUC，X為靶基因啟動子；同列數(shù)據(jù)后*表示差異顯著(p<0.05)。

2.5 基因水平驗證調(diào)控作用

2.5.1 AtHAP5各株系中AtHAP5、HSFA2、A37的表達

為進一步驗證熒光素酶試驗的結果，通過RT-qPCR試驗對不同AtHAP5株系中HSFA2、A37的表達量進行了研究。研究結果發(fā)現(xiàn)，當AtHAP5過量表達時，HSFA2的表達量受到顯著的抑制作用。在athap5突變體中，AtHAP5和HSFA2的表達量與野生型(CW)植株相比輕微下降，而A37的表達并無顯著變化(表3)。

表3 AtHAP5各株系AtHAP5、HSFA2、A37的相對表達量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.5.2PwHAP5各株系中PwHAP5、HSFA2、A37的表達

通過RT-qPCR試驗分別分析在野生型與PwHAP5異源過表達株系中PwHAP5、HSFA2、A37的表達量。研究結果表明，在過表達PwHAP5株系中HSFA2、A37的表達量沒有顯著變化(表4)。

表4 PwHAP5過表達株系PwHAP5、HSFA2、A37的相對表達量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；*表示差異顯著(p<0.05)；CW代表野生型。

3 討論

根據(jù)轉錄因子的調(diào)控方式的不同可以將其分為轉錄抑制子和轉錄激活子[26]。在本研究中，通過轉錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)，PwHPA5和AtHAP5全長沒有轉錄激活活性，且PwHAP5的N端和C端均無轉錄激活活性(圖1)。Hao et al.[27]在研究NAC轉錄因子的激活活性時發(fā)現(xiàn)，大豆NAC轉錄因子GmNAC20的C端具備轉錄激活活性，而全長不具備轉錄激活活性，因為其蛋白N端存在一個NARD抑制結構域，該結構域抑制了C端的轉錄激活活性。因此，我們推測PwHPA5和AtHAP5可能作為轉錄抑制子發(fā)揮作用，或需與NF-Y家族的其他亞基結合，發(fā)揮激活功能[28-31]。

植物HAP復合體已經(jīng)被廣泛地證明在酵母與植物中能與CCAAT box結合。例如，Shi et al.[12]在探究AtHAP5A下游靶基因及其功能時發(fā)現(xiàn)，AtHAP5A作為轉錄因子能夠直接通過與CCAAT結合調(diào)控AtXTH21的表達，并參與了冷脅迫抗性調(diào)控過程。我們的研究結果顯示AtHAP5對HSFA2的表達具有抑制作用，顯示HSFA2可以作為AtHAP5的下游靶基因，受AtHAP5負調(diào)控發(fā)揮作用。然而，EMSA和酵母單雜交試驗發(fā)現(xiàn)AtHAP5不能直接作用于HSFA2的啟動子，說明AtHAP5作為HSFA2的上游調(diào)控因子，并不是直接與HSFA2的啟動子結合，其調(diào)控過程需要其他亞基或蛋白的參與。之前多數(shù)的研究表明，NF-Y亞基發(fā)揮轉錄調(diào)控作用并不是獨立的。NF-YB和NF-YC首先在細胞質(zhì)中形成二聚體，然后一起轉移到細胞核中與NF-YA形成三聚體發(fā)揮調(diào)控作用[28-31]。此外，NF-YC亞基也可以通過與其他非NF-Y家族轉錄因子如AB15發(fā)生相互作用發(fā)揮調(diào)控作用[32]。HIKARU et al.[31]發(fā)現(xiàn)，DPB3-1(NF-YC10)能夠與NF-YA以及NF-YB亞基形成三聚體，這個三聚體又可以與DREB2A相互作用，增強DREB2A對下游靶基因HSFA3的表達調(diào)控作用，進而調(diào)控下游熱脅迫響應基因的表達。擬南芥bZIP28可以與NF-YB3/NF-YC2/NF-YA4形成復合體調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激響應[30]，NF-YC2/LEC1/BbZIP67參與種子萌發(fā)，可以激活ABA響應元件[33]，CONSTANS(CO/B-BOX PROTEIN1 BBX1)蛋白能夠與NF-YB2/NF-YC3形成復合體，與FLOWERINGLOCUST啟動子上CORE元件結合，調(diào)控花期[34]。因此我們推測，AtHAP5對于HSFA2的調(diào)控作用可能是需要NF-Y家族其他亞基或其他轉錄因子協(xié)同完成。

Park et al.[35]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的NF-YA亞基可以與酵母中的NF-YB、NF-YC亞基形成三聚體，與CCAAT順式作用元件結合，說明不同物種NF-Y家族轉錄因子結構具有相似的生化特性，也暗示其在生物體中的功能保守。利用同源基因之間的相似性，有利于基因調(diào)控機制的探索與比較，Yu et al.[15]通過多序列對比發(fā)現(xiàn)，PwHAP5氨基酸序列與AtHAP5氨基酸序列的關鍵結構域保守，相似性達52.09%，因此推測它們在功能上也具有保守性。Liu et al.[36]發(fā)現(xiàn)鹽芥(Eutremasalsugineum)EsNAC1異源株系顯示出與擬南芥同源基因RD26過表達株系不同的表型，且異源株系通過調(diào)控不同靶基因的表達來增強植株的非生物脅迫性。在本研究中AtHAP5對HSFA2的在體內(nèi)表達具有抑制作用，而PwHAP5對HSFA2的表達沒有顯著影響。由此推測PwHAP5在進化上與AtHAP5功能及作用存在差異。

4 結論

青杄PwHAP5與其同源基因擬南芥AtHAP5全長以及PwHAP5的N端與C端均沒有轉錄激活活性，PwHAP5與AtHAP5不能直接作用于HSFA2和A37的啟動子。AtHAP5對HSFA2的在體內(nèi)表達具有抑制作用，可能負調(diào)控AtHSFA2表達。PwHAP5對HSFA2的表達沒有顯著影響，

顯示其在進化上與AtHAP5功能及作用存在差異。