骨髓富集骨移植材料在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎矯治中的應(yīng)用*

楊鵬 侯天勇 邢軍超 羅飛 許建中*

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是在青少年時期出現(xiàn)的原因不明的非先天性三維脊柱畸形，總體發(fā)病率為1% ～3%，其中超過0.02%的患者需要手術(shù)治療[1]。隨著 AIS 手術(shù)治療理念的不斷更新，矯形內(nèi)固定加植骨融合術(shù)已成為臨床應(yīng)用最廣泛且療效最確切的外科治療方法，AIS 的手術(shù)治療不僅依靠器械矯形，更關(guān)鍵在于術(shù)后固定節(jié)段的牢固融合[2]。自體骨被認(rèn)為是脊柱融合術(shù)中骨移植材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]，但伴有骨丟失、神經(jīng)損傷、持續(xù)性疼痛、感染等供區(qū)并發(fā)癥[4]。尤其對于 Lenke 分型為Ⅰ-Ⅲ型的AIS 患者來說，術(shù)中通常不需要切除肋骨，術(shù)中獲得的自體骨不能滿足植骨需要，且青少年骨發(fā)育可能還未完全成熟，取自體髂骨容易破壞骨骺。同種異體骨雖無自體取骨的并發(fā)癥，但經(jīng)處理后骨誘導(dǎo)活性和生物力學(xué)性能降低、新骨爬行替代過程緩慢，骨不連發(fā)生率高[5]。因此，尋找具有良好生物學(xué)活性和強(qiáng)度的植骨替代材料已引起廣泛重視。本研究利用選擇性細(xì)胞滯留（selective cell retention，SCR）技術(shù)富集自體骨髓，與同種異體骨復(fù)合構(gòu)建骨髓富集骨移植材料，探討其用于AIS 植骨融合的臨床效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)及患者家屬同意，自2014 年7月至2016 年9 月共31 例 AIS 患者參與本研究，其中男14例，女17 例，年齡12 ～ 20 歲，平均年齡15 歲。納入標(biāo)準(zhǔn):脊柱側(cè)彎畸形嚴(yán)重影響美觀，側(cè)彎角度大于45°或每年進(jìn)展超過5°，Lenke 分型為Ⅰ-Ⅲ型[6];年齡10 ～ 20歲，不限性別;無其他系統(tǒng)疾病及吸煙史;近期未參加其他研究。排除標(biāo)準(zhǔn):脊柱僵硬的伴剃刀背畸形需要切除肋骨;合并強(qiáng)直性脊柱炎、脊柱結(jié)核、脊柱腫瘤等其他脊柱疾病;合并其他系統(tǒng)疾病或有吸煙史;患精神心理疾病不能按計劃完成隨訪。按患者就診先后順序，隨機(jī)（數(shù)字表法）分為對照組和觀察組。其中對照組14 例，采用同種異體骨作為植骨融合材料; 觀察組17 例，采用骨髓富集骨移植材料作為植骨融合材料。

1.2 方法

1.2.1 自體骨髓采集

配制1 000 U/mL 的肝素生理鹽水，提前吸入注射器中備用。選擇髂前上棘或髂后上棘或預(yù)植入椎弓根螺釘?shù)淖倒鶠楣撬璐┐厅c(diǎn)，用含肝素鹽水的注射器抽取適量的骨髓，每個位點(diǎn)抽吸骨髓5 mL，即刻搖勻，每個點(diǎn)間隔2 cm 以上，總量以每克植骨材料準(zhǔn)備5 ～6 mL 骨髓為宜。

1.2.2 骨髓富集

將骨髓注入已裝填同種異體骨（松質(zhì)骨顆粒和皮質(zhì)骨粉1∶1 混合）的椎杯中，蓋緊外蓋，均勻用力按壓骨生長富集器（富沃，重慶）手柄至平齊頂部后松開，在恒力彈簧提供的負(fù)壓作用下，自動完成1 次骨髓富集操作，并將骨髓回吸入回流筒中。待骨髓完全回流、手柄恢復(fù)到初始位置后，再次按壓手柄開始第2 次循環(huán)。累計4 次上述富集操作，即完成骨髓富集骨移植材料的構(gòu)建，總過程為5 ～10 min。

1.2.3 手術(shù)方法

兩組患者手術(shù)均由同一位醫(yī)師主刀。患者全麻俯臥位，行后正中切口，逐層切開皮膚、皮下組織和椎旁肌肉，顯露雙側(cè)椎板、上下關(guān)節(jié)突和橫突。于進(jìn)針點(diǎn)咬除骨皮質(zhì)，定位器定位、開孔，探針探查孔壁四周為骨性結(jié)構(gòu)，選擇合適大小的椎弓根螺釘植入，將預(yù)彎好的棒置入椎弓根螺釘內(nèi)，去旋轉(zhuǎn)，矯正畸形，C 臂 X 線機(jī)再次透視見側(cè)彎畸形在冠狀面、矢狀面矯正均滿意，旋緊螺釘及棒。對擬融合椎體兩側(cè)椎板去皮質(zhì)化，根據(jù)組別植入不同骨移植材料，留置引流管和逐層縫合切口。術(shù)中行神經(jīng)電生理監(jiān)測，矯形結(jié)束時行喚醒試驗。

1.3 術(shù)后處理

術(shù)后常規(guī)使用抗生素24 h 預(yù)防感染，術(shù)后48 ～72 h 視術(shù)區(qū)引流情況予以拔除術(shù)區(qū)引流管，術(shù)后1 周在支具保護(hù)下逐步下床活動。

1.4 隨訪及觀察指標(biāo)

治療后隨訪24 個月，對兩組患者的圍手術(shù)期資料、影像學(xué)表現(xiàn)、臨床療效等進(jìn)行評估。圍手術(shù)期資料: 手術(shù)時間、術(shù)中出血量、住院時間;影像學(xué)表現(xiàn): 矯正率、矯正丟失、按脊柱融合 Lenke 分級標(biāo)準(zhǔn)評定融合情況（見表1，A 級和B 級均評定為骨融合）[7];臨床療效: 視覺模擬評分（VAS）、Oswestry 功能障礙指數(shù)（ODI）[8]、脊柱側(cè)凸研究協(xié)會30 項（SRS-30）[9]、并發(fā)癥。

表1 脊柱融合Lenke 字母分級標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0（SPSS 公司，美國）統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本 檢驗，組內(nèi)手術(shù)前后比較采用配對樣本 檢驗; 計數(shù)資料比較采用檢驗，<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者數(shù)量分析

31 例患者全部獲得隨訪，均進(jìn)入結(jié)果分析，無脫落。

2.2 兩組患者基本資料比較

兩組患者在性別比、年齡、Lenke 分型、融合節(jié)段數(shù)、植骨量等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），具有可比性，見表 2。

表2 兩組患者基本資料比較

2.3 兩組患者圍手術(shù)期資料比較

兩組患者在術(shù)中出血量、手術(shù)時間、住院時間等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），見表 3。

2.4 兩組患者矯形效果和融合情況比較

觀察組術(shù)后矯正率、末次隨訪矯正丟失略優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），見表 4。觀察組術(shù)后 6 個月融合率高于對照組，對照組融合率為（1+7）/14=57.14%,觀察組融合率為（5+8）/17=76.47%，見表5。末次隨訪時兩組間患者脊柱融合 Lenke 分級比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義見表 6。

2.5 兩組患者臨床評分比較

末次隨訪時所有患者 VAS、ODI 評分較術(shù)前均明顯下降（<0.01），但兩組間術(shù)前及末次隨訪比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05）。末次隨訪時所有SRS-30 總分及疼痛、自我形象、滿意度 3 個維度的評分較術(shù)前均明顯上升（<0.01）; 心理、功能/活動2 個維度的評分與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），兩組間SRS-30 總分和各維度評分在術(shù)前與末次隨訪時均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表7。

表3 兩組患者圍手術(shù)期資料比較

表4 兩組患者畸形矯正數(shù)據(jù)比較

表5 兩組患者術(shù)后6 個月脊柱融合Lenke 分級比較

表6 兩組患者末次隨訪脊柱融合Lenke 分級比較

表7 兩組患者臨床評分比較分）

表7 兩組患者臨床評分比較分）

指標(biāo) 術(shù)前 末次隨訪對照組（n=14） 觀察組（n=17） 對照組（n=14） 觀察組（n=17）VAS 1.71±0.61 2.00±0.78 0.21±0.43 0.35±0.49 ODI 6.03±2.53 6.80±2.62 1.27±1.43 1.31±1.35 SRS-30疼痛 4.15±0.32 4.23±0.50 4.40±0.23 4.48±0.11心理 4.16±0.20 4.21±0.16 4.18±0.17 4.22±0.22功能/活動 3.92±0.27 3.93±0.17 4.01±0.88 4.01±0.93自我形象 3.22±0.50 3.34±0.41 4.06±0.25 4.19±0.18滿意度3.39±0.33 3.44±0.27 4.27±0.18 4.33±0.09

2.6 并發(fā)癥

兩組患者均未發(fā)生螺釘松動、斷裂和斷棒等并發(fā)癥，觀察組1例患者術(shù)后出現(xiàn)傷口愈合不良，經(jīng)清創(chuàng)及抗感染治療后痊愈。

典型病例1: 對照組患者，女，15 歲，青少年脊柱側(cè)彎畸形（Lenke ⅠA 型），行脊柱側(cè)彎矯形+同種異體骨植骨融合術(shù)（見圖1）。

圖1 A.術(shù)前X 線片;B.術(shù)后1 周X 線片;C.術(shù)后2 年X 線片;D.術(shù)中植骨照片;E.術(shù)后6 個月CT 掃描矢狀面;F.術(shù)后6 個月CT 掃描橫斷面，脊柱融合Lenke 分級評定為C 級;G、H.術(shù)后2 年矯形效果良好

典型病例2: 觀察組患者，男，16 歲，青少年脊柱側(cè)彎畸形（Lenke ⅡC 型），行脊側(cè)彎矯形+骨髓富集骨移植材料植骨融合術(shù)（見圖2）。

圖2 A.術(shù)前X 線片;B.術(shù)后1 周X 線片;C.術(shù)后2 年X 線片;D.術(shù)中植骨照片;E.術(shù)后6 個月CT 掃描矢狀面;F.術(shù)后6 個月CT 掃描橫斷面，脊柱融合Lenke 分級評定為A 級;G、H.術(shù)后2 年矯形效果良好

3 討論

目前，脊柱融合術(shù)已經(jīng)成為治療創(chuàng)傷、腫瘤、感染、退變、畸形等脊柱疾病的常見方法[10]。通過使用骨移植材料行脊柱融合術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，由于脊柱融合對骨移植材料數(shù)量和質(zhì)量要求較高，所以骨移植材料被認(rèn)為是影響脊柱融合手術(shù)成功的重要因素。干細(xì)胞治療的興起為克服自體骨和異體骨等傳統(tǒng)骨移植材料的缺陷，構(gòu)建理想的骨移植材料提供了新的希望。

研究證實，骨髓中含有可促進(jìn)脊柱融合的多種干細(xì)胞和生長因子[11]。然而，這些細(xì)胞和因子在骨髓中濃度較低，如可分化為成骨細(xì)胞的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）僅占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01%[12]。已有學(xué)者報道，注射到骨折斷端或是骨不連部位可以促進(jìn)骨愈合[13]，但骨髓不經(jīng)任何細(xì)胞分離或純化等處理，無法達(dá)到高濃度，直接回植療效常不穩(wěn)定。組織工程技術(shù)已在臨床應(yīng)用并取得了不錯的治療效果[14]，但BMSCs 體外培養(yǎng)擴(kuò)增操作程序尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)且耗時過長，還不能廣泛運(yùn)用于臨床。骨髓富集技術(shù)可提高單位體積內(nèi)干細(xì)胞和生長因子的數(shù)量，極大提高骨髓成骨的有效成分，為更好地利用骨髓、促進(jìn)成骨提供了新思路。Sauerbier 等[15]利用離心技術(shù)富集骨髓，發(fā)現(xiàn)富集后的骨髓與牛骨礦物質(zhì)混合后可達(dá)到自體骨與牛骨礦物質(zhì)混合的成骨能力。Gan 等[16]通過離心技術(shù)富集BMSCs，并復(fù)合 -磷酸三鈣應(yīng)用到41 例患者的脊柱后路融合術(shù)中，隨訪34.5 個月后95.1%的患者實現(xiàn)了良好的融合效果。但利用離心技術(shù)富集骨髓所需骨髓量較大，且需要一個專門的實驗室及專業(yè)人員進(jìn)行操作，其他有利于成骨的生長因子未能得到利用。另一種骨髓富集技術(shù)是由Muschler 等[17]提出的SCR 技術(shù)，其基本原理是利用富集材料合適的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和良好的表面黏附性能，在骨髓以一定流速流經(jīng)富集材料時，可將骨髓中成骨相關(guān)的干細(xì)胞和細(xì)胞因子選擇性滯留于富集材料中。Hou 等[18]對富集材料進(jìn)行修飾后，發(fā)現(xiàn)利用SCR 技術(shù)可將骨髓中的有核細(xì)胞、單核細(xì)胞、BMCs 以及造血干細(xì)胞富集5、12、11.5、10.2 倍，骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、人血小板衍生生長因子 BB、血管內(nèi)皮生長因子以及表皮細(xì)胞生長因子富集 1.38、1.30、1.65、3.95倍。在動物實驗中，Brodke 等[19]以犬為動物模型，利用SCR 技術(shù)將骨髓富集在脫鈣骨基質(zhì)和松質(zhì)骨屑中，發(fā)現(xiàn)其修復(fù)股骨缺損的能力與自體骨相當(dāng)。Gupta 等[20]以羊為動物模型，利用SCR 技術(shù)將骨髓富集在磷酸三鈣（TCP）中，發(fā)現(xiàn)其與自體骨在羊后外側(cè)腰椎融合術(shù)中實現(xiàn)了相似的融合率。在臨床研究中，Lee 和Goodman[21]以脫鈣骨基質(zhì)和松質(zhì)骨屑為富集材料，復(fù)合 SCR 技術(shù)富集的自體骨髓治療3例廣泛性股骨髁壞死，隨訪2 年發(fā)現(xiàn)患者功能恢復(fù)良好。Fitzgibbons 等[22]將SCR 技術(shù)應(yīng)用到足踝手術(shù)中，以同種異體骨為富集材料，發(fā)現(xiàn)可以提高材料的骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨生成能力。

本研究第一次將SCR 技術(shù)應(yīng)用到脊柱側(cè)彎畸形的矯治中，且是第一個關(guān)于SCR 技術(shù)臨床應(yīng)用的前瞻性隨機(jī)對照研究。經(jīng)過隨訪24 個月發(fā)現(xiàn)，觀察組矯正率和矯正丟失略優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05），即兩種材料均能達(dá)到治療目的，實現(xiàn)良好的畸形矯正和矯正維持效果。在脊柱融合方面，術(shù)后6 個月觀察組融合率高于對照組，說明骨髓富集材料實現(xiàn)脊柱融合速度快于單純同種異體骨材料。末次隨訪時觀察組脊柱融合Lenke 分級情況略優(yōu)于對照組，說明骨髓富集材料最終融合效果稍優(yōu)于對照組。分析臨床評分發(fā)現(xiàn)，末次隨訪時所有患者 VAS、ODI 評分均低于術(shù)前，但兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩種骨移植材料均能使患者的疼痛及功能情況得到改善。末次隨訪時所有患者 SRS-30 總分較術(shù)前明顯增加，其中疼痛、自我形象、滿意度3 個維度的評分較術(shù)前增加，心理、功能/活動2 個維度的評分較術(shù)前無明顯變化，可能是由于入組患者畸形程度并未明顯影響日?；顒佑嘘P(guān)[23]。兩組間SRS-30 總分及各維度評分在術(shù)前與末次隨訪時比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩種骨移植材料均能使患者的生活質(zhì)量得到提高。除了觀察組1 例患者出現(xiàn)傷口愈合不良外，隨訪期間未觀察到其余并發(fā)癥，說明骨髓富集骨移植材料的臨床應(yīng)用是安全可靠的。

在本研究中，同種異體骨被用做富集材料，并將其松質(zhì)骨顆粒和皮質(zhì)骨粉進(jìn)行1∶1 混合，以減小材料孔徑，增加富集效率。經(jīng)過脫脂、脫蛋白等降抗原性處理后，同種異體骨的骨誘導(dǎo)和骨生成能力降低，但仍保留了骨組織天然的三維結(jié)構(gòu)，且具有原有的骨小梁和骨小梁間隙，有利于細(xì)胞的黏附和生長[24]。同種異體骨復(fù)合富集骨髓構(gòu)建的骨髓富集骨移植材料既能為成骨提供較高濃度的干細(xì)胞和細(xì)胞因子，又能為骨生長提供支架，有與自體骨相似的功能，較單純同種異體骨融合效果更好。此外，利用SCR 技術(shù)富集骨髓操作簡單安全，需要骨髓量較少，耗時短，可實現(xiàn)術(shù)中即刻構(gòu)建骨移植材料，規(guī)避了許多技術(shù)與倫理學(xué)方面的限制。

綜上所述，研究初步證實，利用SCR 技術(shù)富集自體骨髓并復(fù)合同種異體骨構(gòu)建的骨髓富集材料，將其應(yīng)用于脊柱融合之中，可獲得理想的效果，為臨床上術(shù)中即刻構(gòu)建高活性骨移植材料提供了新的思路。