李卉 王林群 張雪榮
摘要 目的:探討復(fù)方中藥金水清合劑對(duì)IgA腎病大鼠TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA表達(dá)的影響。方法:4周齡SPF級(jí)SD大鼠40只,隨機(jī)分為正常組、模型組、治療1組、治療2組、治療3組,復(fù)制大鼠IgA腎病模型,觀察組在模型組的基礎(chǔ)上,分別于第5周、第7周、第9周,給予金水清合劑灌胃治療,1次/d,至第12周末,HE及PAS染色觀察腎臟病理學(xué)改變,Western-blot檢測腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果:正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整清晰,模型組大鼠可見腎小球系膜區(qū)增寬,系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞中到重度增生,觀察組病變程度比模型組輕,治療1組改善最為明顯。與正常組比較,模型組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達(dá)升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組表達(dá)降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);觀察組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與正常組比較,模型組TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA的表達(dá)升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組表達(dá)降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);觀察組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:金水清合劑能顯著改善IgA腎病大鼠腎臟損害,早期治療改善最為明顯,其作用機(jī)制可能為下調(diào)TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)。
關(guān)鍵詞 金水清合劑;IgA腎病;大鼠模型;TGF-β1;CTGF;VEGF
Abstract Objective:To investigate the effects of Jinshuiqing Mixture on the expression of TGF-β1,CTGF,VEGF protein and mRNA in IgA nephropathy rats.Methods:A total of 40 4-week-old SPF SD rats were randomly divided into a normal groups,a model group,treatment group 1,treatment group 2 and treatment group 3.Rat IgA nephropathy model was copied.Based on the model group,the treatment group was given Jinshuiqing Mixture by gavage once per day in the 5th week,the 7th week and the 9th week respectively till the end of 12th week.Pathological changes in kidney were observed by HE staining and PAS staining.The protein expression of TGF-β1,CTGF and VEGF was detected by Western blot,and the expression of TGF-β1,VEGF and CTGF and mRNA was detected by RT-PCR.Results:In the normal group,the renal tissue structure was complete and clear.In the model group,mesangial area was widened,and mesangial cells and mesangial matrix were moderately to severely proliferated.The degree of lesions in the treatment group was lighter than that in the model group.And the improvement of treatment group 1 was the most obvious one.Compared with the normal group,the expression of TGF-β1,CTGF and VEGF protein in the model group increased significantly and the difference was statistically significant (P<0.05); compared with the model group,the expression in the treatment group decreased greatly and the difference was statistically significant (P<0.05); compared among the treatment groups,and the difference was statistically significant (P<0.05); compared with the normal group,the expression of TGF-β1,CTGF,VEGF mRNA in the model group was significantly higher,and there was significant difference (P<0.05); compared with the model group,the expression in the treatment group was lower,and the difference was statistically significant (P<0.05); compared among the treatment groups,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion:Jinshuiqing Mixture can significantly improve the renal damage of IgA nephropathy rats,and early treatment improvement is most obvious.Its mechanism may be down regulating the expression of TGF-β1,CTGF,VEGF protein and mRNA.
Keywords Jinshuiqing Mixture; IgA nephropathy; Rat model; TGF-β1; CTGF; VEGF
IgA腎病是一種常見的原發(fā)性腎小球疾病,是引起兒童血尿的主要疾病之一[1],部分可以伴有不同程度蛋白尿,一項(xiàng)國內(nèi)大樣本多中心的調(diào)查資料顯示45.25%患者病理改變?yōu)棰?Ⅴ級(jí),病情多數(shù)呈慢性進(jìn)行性發(fā)展,并逐漸出現(xiàn)腎臟功能受損[2]。對(duì)于IgA腎病鏡下血尿是否需要治療,存在爭議,主要是早期治療能否阻止或延緩腎臟功能受損?,F(xiàn)代研究認(rèn)為腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)增生是IgA腎病進(jìn)展到終末期腎病的重要通路[3]。湖北省中醫(yī)院國家名老中醫(yī)倪珠英教授創(chuàng)立并研制了治療血尿的金水清合劑(金水清),主要是針對(duì)血尿濕熱證表現(xiàn)患者,對(duì)血尿癥狀改善臨床療效顯著[4],本研究擬觀察金水清在疾病不同時(shí)期干預(yù)對(duì)大鼠腎臟組織TGF-β1、CTGF、VEGF表達(dá)的影響,探討金水清治療IgA腎病的作用機(jī)制及早期干預(yù)是否能延緩IgA腎病腎臟病理進(jìn)展,并最終改善預(yù)后。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物
4周齡健康SPF級(jí)別SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量(100±10)g,由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018,飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,屏障環(huán)境,溫度(24±1)℃,相對(duì)濕度(55±10)%,12 h光照晝夜循環(huán),造模期按要求置于人工氣候箱調(diào)節(jié)溫度濕度。
1.1.2 藥物
金水清合劑(湖北省中醫(yī)院制劑室生產(chǎn),批號(hào):鄂藥制字Z20113149),制作方式:由漏蘆、連翹、甘草等份用水蒸汽蒸餾,提取芳香水,再煎煮濃縮至1 g/mL,與提取芳香水混勻,無菌條件下灌裝。
1.1.3 試劑與儀器
牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司,貨號(hào):G5001-100);脂多糖(LPS,Solarbio公司,貨號(hào):L8880);四氯化碳(CCl4)(湖北醫(yī)藥集團(tuán)宏科化工儀器有限公司,貨號(hào):00023);IgA試劑(NOVUS公司,貨號(hào):NB7110);BCA蛋白濃度試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號(hào):G2026);RIPA裂解液(Servicebio公司,貨號(hào):G2002)、磷酸化蛋白酶抑制劑(Servicebio公司,貨號(hào):G2007)、顯影定影試劑(Servicebio公司,貨號(hào):G2007)、β-actin(Servicebio公司,貨號(hào):G2007)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(Servicebio公司,貨號(hào):GB23303)、HRP標(biāo)記驢抗山羊(Servicebio公司,貨號(hào):GB23404)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(Servicebio公司,貨號(hào):GB23301)、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(Servicebio公司,貨號(hào):GB23302)、TBS緩沖液(Servicebio公司,貨號(hào):GB0001)、脫脂奶粉(Servicebio公司,貨號(hào):G5002),RNA提取液(Servicebio公司,貨號(hào):G3013)。
冷凍離心機(jī)(Heal force,型號(hào):neofuge 13R),純水儀(重慶艾科浦,型號(hào):AJC-0501-P),電泳儀(北京六一儀器廠,型號(hào):DYY-6C),灰度分析軟件(Alpha Innotech,型號(hào):AlphaEaseFC),勻漿儀(康濤科技有限公司,型號(hào):KZ-II),超微量分光光度計(jì)(Thermo公司,型號(hào):THM#10300101),人工氣候箱(金壇市訊生儀器廠,型號(hào):RZ-280B)。
高糖高脂飼料,由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,配方為:50 kg飼料含豬油5 kg,蛋黃粉2.5 kg,膽固醇0.5 kg,膽酸鈉0.1 kg,糖7.5 kg,基礎(chǔ)飼料34.4 kg。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備
40只大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,試紙檢測尿紅細(xì)胞、尿蛋白全部為陰性,隨機(jī)分為5組,每組8只,分別為正常組、模型組、治療1組、治療2組、治療3組。
正常組:正常飼料喂養(yǎng)。隔日灌服酸化水2 mL,第6、8周尾靜脈注射生理鹽水0.5 mL。
模型組:持續(xù)高糖高脂飲食,隔日灌胃含0.1%BSA的酸化水(400 mg/kg)2 mL,1次/周皮下注射CCl4 0.1 mL+花生油0.3 mL,共12周。在第4周時(shí),增加環(huán)境因素,將大鼠置于恒溫恒濕箱中共120 h(溫度由28~35 ℃,濕度由70%~95%),溫度和濕度逐步提升,每天不超過5 ℃,溫度濕度峰值不超過24 h,120 h后移至自然環(huán)境。第6周尾靜脈注射1%BSA酸化水20 mg/(kg·次),1次/d,連續(xù)3次,第6周、8周尾靜脈注射LPS(0.05 mg/只)1次,觀察至第12周末。尿液經(jīng)尿沉渣分析儀檢測出現(xiàn)血尿或蛋白尿,腎臟病理改變符合系膜增殖性腎炎表現(xiàn),免疫熒光有IgA沉積,提示造模成功。
觀察組:在模型組的基礎(chǔ)上,給予金水清合劑灌胃。
1.2.2 給藥方法
觀察組在模型組的基礎(chǔ)上,給予金水清合劑灌胃,給藥劑量均為6.3 g/(kg·d)。根據(jù)灌胃起始時(shí)間不同分為治療1組、治療2組、治療3組,起始時(shí)間分別為第5周、第7周、第9周,1次/d,至第12周末。
1.2.3 檢測指標(biāo)與方法
光鏡:第12周治療結(jié)束,頸椎脫臼法處死大鼠。切取右側(cè)腎臟,HE及PAS染色觀察腎臟病理學(xué)改變。
Western-blot檢測腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白的表達(dá):冷PBS液體、洗滌腎組織塊,共2~3次,剪刀剪成小塊置于勻漿管中。加入直徑2 mm的小磁珠,1~2個(gè),加入試劑(為組織體積的10倍)徹底勻漿。在4 ℃條件下離心,12 000 r/min,10 min,離心半徑22 cm,離心后的中間清亮液體即為組織總蛋白質(zhì)。將蛋白溶液按照4∶1加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴變性15 min,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照?shí)驗(yàn)的需要配制相應(yīng)濃度的分離膠,加入TEMED后立即搖勻后灌膠。分離膠凝固后倒去膠上層水并用吸水紙吸干。SDS-PAGE電泳,濃縮膠電壓75 V,分離膠電壓120 V。溴酚藍(lán)剛跑出時(shí)終止電泳,然后轉(zhuǎn)膜、顯色。掃描膠片并存檔,PhotoShop整理去色,Alpha軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。
RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA的表達(dá):腎組織放于-80 ℃貯存待用。RT-PCR檢測TGF-β1、VEGF及CTGF mRNA表達(dá)水平。按Trizol(美國Invitrogen)說明書提取各組腎皮質(zhì)總RNA,并反轉(zhuǎn),錄成cDNA。引物序列采用Primer5.0統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。以β-actin為內(nèi)參基因,引物均由Servicebio公司合成。見表1。應(yīng)用CT法:
A=CT目的基因-CTβ-actin,B=CT目的基因-CT內(nèi)標(biāo)基因,K=A-B,表達(dá)倍數(shù)=2-K。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,其中計(jì)數(shù)資料以(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察
正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整清晰,腎小球體積形態(tài)正常,腎小囊內(nèi)無明顯滲出,系膜細(xì)胞及系膜區(qū)無增生,腎小管結(jié)構(gòu)完整,管腔內(nèi)未見明顯管型,無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠可見腎小球腫脹,腎小球內(nèi)細(xì)胞增多,系膜區(qū)增寬,中到重度系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生,毛細(xì)血管管腔狹窄,袢開放不良,部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性,腎小管間質(zhì)有少許炎性細(xì)胞浸潤。各觀察組病理改變程度均比模型組輕,治療1組改善最為明顯。見圖1。
2.2 各組腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達(dá)的比較
與正常組比較,模型組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達(dá)升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白表達(dá)降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療1組與治療2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療2組與治療3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖2。
2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達(dá)的比較
與正常組比較,模型組TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表達(dá)升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGFmRNA的表達(dá)降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療1組與治療2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療2組與治療3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
3 討論
我院國家級(jí)名老中醫(yī)倪珠英教授在兒童血尿診治方面臨床療效顯著[5],提倡早期治療,認(rèn)為兒童血尿的主要病機(jī)是“以熱為先,因濕為重”[6-7],主張濕熱既是導(dǎo)致IgA腎病發(fā)生的重要因素,又是影響其轉(zhuǎn)歸的病理關(guān)鍵,治療當(dāng)以清熱利濕為法,據(jù)此研制了湖北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑“金水清合劑”,已投入臨床20余年。有臨床研究顯示[8],IgA腎病患者中,濕熱體質(zhì)的占46.7%,在IgA腎病中醫(yī)證型病理研究中發(fā)現(xiàn),以濕熱證為主,且濕熱證患者的病理損傷程度和疾病嚴(yán)重程度均高于非濕熱證患者[9],認(rèn)為濕熱證可能提示患者細(xì)胞免疫處于活躍狀態(tài),大量釋放細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)遞質(zhì),導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積增多,病理損傷加重[10]。金水清治療IgA腎病是通過改善患者的濕熱癥狀來緩解血尿情況,最終影響IgA腎病結(jié)局,我們對(duì)其具體干預(yù)機(jī)制做了進(jìn)一步研究。
IgA腎病的預(yù)后與腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)[3],逆轉(zhuǎn)致纖維化的一些可溶性因子釋放,被認(rèn)為是抗纖維化治療的重點(diǎn),其中炎性反應(yīng)因子起著至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor,TGF-β)是介導(dǎo)腎小球疾病進(jìn)展的重要因子,其正常表達(dá)時(shí)通過抑制細(xì)胞增殖來維持正常的細(xì)胞數(shù)量從而抑制炎性反應(yīng),當(dāng)其過度表達(dá),可以刺激成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),抑制ECM的降解,還能誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的聚集,激活腎小管上皮細(xì)胞啟動(dòng)自噬機(jī)制,導(dǎo)致腎小管變性[11],是促進(jìn)腎纖維化的最重要的細(xì)胞因子之一[12]。有研究表明,在腎小球硬化腎炎各組中腎小球內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組,認(rèn)為TGF-β1參與了病變腎小球中的細(xì)胞外基質(zhì)過量蓄積,在腎小球硬化過程中起重要作用[13]。
結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)為TGF-β1促纖維化信號(hào)通路中的下游遞質(zhì)分子,主要通過TGF-β1/Smads途徑,在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。CTGF表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞[14],TGF-β1是其最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑[15]。TGF-β1可刺激多種細(xì)胞分泌CTGF,主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)CTGF的表達(dá),CTGF水平又可反向作用于相關(guān)細(xì)胞,調(diào)節(jié)TGF-β1對(duì)這些細(xì)胞的合成和促增生作用。雖然TGF-β1是導(dǎo)致組織纖維化形成的重要細(xì)胞因子之一,但它作用的靶細(xì)胞較多,效應(yīng)多樣,除能促細(xì)胞增生和誘導(dǎo)組織纖維化外,還有抗細(xì)胞分化和抗炎等功能,因此完全阻斷其表達(dá)或活性,可能會(huì)影響相應(yīng)細(xì)胞正常功能[16];與此相反,CTGF在生理狀態(tài)下表達(dá)水平較低,生物學(xué)效應(yīng)相對(duì)單一,它可能僅介導(dǎo)TGF-β1的部分生物學(xué)效應(yīng),主要是刺激細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成,會(huì)促進(jìn)組織器官纖維化。因此,近年來將其作為一個(gè)比TGF-β1更特異、更有效地預(yù)防纖維化的治療新靶點(diǎn)[17]。
血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性性促有絲分裂原,能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化,增加血管通透性,加速新生血管生成[18],在組織缺氧狀態(tài)下,可大量生成,改善組織缺血,另一方面,當(dāng)腎臟組織受損,如系膜增生、內(nèi)皮細(xì)胞受損或是基底膜破壞,導(dǎo)致腎小球局部缺氧,可以使腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF高表達(dá)[19],進(jìn)而促進(jìn)不成熟血管形成,導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂,加重腎臟損害[20-21]。有研究表明,該因子過高表達(dá)還可以引起腎小管萎縮、纖維化,參與蛋白尿的發(fā)生,其水平與尿蛋白呈正相關(guān),并發(fā)現(xiàn)IgA腎病進(jìn)展患者血液及腎臟組織的VEGF表達(dá)顯著增強(qiáng),提示其對(duì)腎臟病的預(yù)后有一定預(yù)測作用[22]。
細(xì)胞因子對(duì)腎臟細(xì)胞并非孤立地發(fā)揮直線作用,是通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)與細(xì)胞的相互作用,在多因素多方向共同影響著腎臟疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。我們早期的研究表明金水清可以緩解模型大鼠的濕熱癥狀,減輕血尿、蛋白尿水平及病理損傷[23],并從多個(gè)角度分析了金水清治療IgA腎病機(jī)制,實(shí)驗(yàn)證實(shí)[7,24-26]:金水清能抑制系膜細(xì)胞的增殖及代謝活性,誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的凋亡;下調(diào)炎性反應(yīng)因子NF-κB水平,減輕腎臟炎性反應(yīng)[27]。本研究綜合前期基礎(chǔ),通過監(jiān)測促腎臟纖維化炎性反應(yīng)因子表達(dá)水平的變化,觀察中藥金水清早期干預(yù),對(duì)于減輕血尿及腎臟損害,從而抑制腎纖維化作用機(jī)制。結(jié)果顯示,各觀察組病理改變程度均比模型組輕,治療1組改善最為明顯;與模型組比較,觀察組1組、觀察組2組、觀察組3組TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療1組與治療2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療2組與治療3組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明金水清合劑能顯著改善IgA腎病大鼠腎臟損害,早期治療改善更為明顯,其延緩IgA腎病病理損傷的作用機(jī)制可能與下調(diào)腎臟組織TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。
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(2020-03-25收稿 責(zé)任編輯:徐穎)